[发明专利]三孢布拉霉负菌crgA基因及其克隆和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，主要是涉及一种三孢布拉霉负菌调控因子crgA基因、克隆方法与应用。

背景技术

三孢布拉霉属于接合菌门接合菌纲毛霉目笄霉科，是一种异宗接合菌，有正菌和负菌之分，其中负菌是合成类胡萝卜素的主要宿主。三孢布拉霉生物量大，类胡萝卜素产量高，被认为是工业化生产天然β-胡萝卜素和番茄红素的理想微生物。而目前三孢布拉霉的遗传背景尚未弄清，成为进一步提高类胡萝卜素产量的瓶颈。本发明从三孢布拉霉类胡萝卜素合成的关键调控基因入手，为提高类胡萝卜素产量奠定技术基础。

crgA基因是在卷枝毛霉中发现的一个负调控因子^[1]，该基因缺失突变后能够引起类胡萝卜素合成关键酶基因(carRA和carB)表达水平和类胡萝卜素合成量的提高。在卷枝毛霉中，crgA基因与一光受体蛋白基因相互作用影响类胡萝卜素的表达，crgA基因的存在可能会促进某一光受体蛋白的泛素化，从而使得类胡萝卜素结构基因表达得到活化^[2]。有研究者在三孢布拉霉正菌中发现了crgA的同源基因^[3]，并将该基因导入卷枝毛霉ΔcrgA突变株中能恢复其野生型表型，证实了该基因序列在丝状真菌中具有较高的保守性。如通过基因工程技术克隆出三孢布拉霉负菌中的crgA基因，将有助于利用三孢布拉霉负菌生产类胡萝卜素，具有很好的应用前景。

本发明除利用基因工程技术成功克隆出三孢布拉霉负菌的crgA基因外，还将对该基因进行敲除，在表型特征、关键酶基因转录水平、类胡萝卜素合成水平等方面将基因敲除株与野生株进行比较分析。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种三孢布拉霉负菌的crgA基因；第二目的在于提供一种所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的克隆方法；第三目的在于构建一种crgA基因原核表达体系；第四目的在于对三孢布拉霉负菌crgA基因的分析；第五目的在于初步探索crgA基因调控三孢布拉霉合成类胡萝卜素的作用机制；第六目的在于为研究三孢布拉霉产类胡萝卜素的调控作用以及三孢布拉霉的光诱导机制奠定了重要基础。

本发明第一目的是这样实现的,所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明第二的是这样实现的,所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的克隆方法包括如下步骤：

(1)从NCBI寻找三孢布拉霉正菌crgA基因序列，分四段进行克隆并分别设计引物：

F1(up)：GGAAATTAAGCTATGCACCGCAGTATAGTC

F1(down)：AGGAAGGTTTGAACAGAAAACTCTTGTAGC

F2(up)：GGTAATGTATGTCGGTGTTGGTT

F2(down)：ACTCGGTTGAAGTGCGATTGTAT

F3(up)：AGTTAAAGCAATTCAAGCTTCGATTCTA

F3(down)：CTTTAAGAAATGCAACAAGTAGCAGGTG

F4(up)：ACAGACGACTGAAGAGATGATTGATGAACT

F4(down)：TATTTTCATATGGAACAAGATTTGTCTATA

(2)三孢布拉霉负菌的基因组DNA为模板，使用上述引物进行PCR扩增。

(3)对所得的PCR产物进行回收和纯化；

(4)将所得PCR产物通过质粒的构建转化到大肠杆菌进行扩增，再进行抽提测序。

本发明中从NCBI中寻找的三孢布拉霉正菌的crgA基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明第三目的是这样实现的,所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的原核表达体系包括crgA基因，PMD-18T载体和大肠杆菌DH5ɑ。

本发明第四目的是这样实现的,将负菌crgA基因测序结果输入DNAMAN与三孢布拉霉正菌crgA基因序列进行比对。

本发明第五目的是这样实现的,将三孢布拉霉负菌crgA基因敲除，再测定菌内的类胡萝卜素结构基因的表达和类胡萝卜素的含量。

本发明提供的三孢布拉霉负菌的crgA基因具有重要的应用价值，而三孢布拉霉负菌是β-胡萝卜素和番茄红素的主要生产菌，因此在负菌中进行该基因的确定以及调控类胡萝卜素合成的研究具有重要的理论意义和潜在的经济价值。

附图说明