[发明专利]三孢布拉霉负菌crgA基因及其克隆和应用

权利要求书

1.一种丝状真菌类胡萝卜素合成关键调控因子crgA基因，其特征在于所述的三孢布拉霉调控基因crgA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利1所述的三孢布拉霉调控基因crgA，其特征在于其来源于负菌，根据三孢布拉霉正菌的crgA基因序列设计引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种权利1所述的三孢布拉霉crgA基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)以三孢布拉霉负菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，使用的上下游引物分别为：

F1(up)：GGAAATTAAGCTATGCACCGCAGTATAGTC

F1(down)：AGGAAGGTTTGAACAGAAAACTCTTGTAGC

F2(up)：GGTAATGTATGTCGGTGTTGGTT

F2(down)：ACTCGGTTGAAGTGCGATTGTAT

F3(up)：AGTTAAAGCAATTCAAGCTTCGATTCTA

F3(down)：CTTTAAGAAATGCAACAAGTAGCAGGTG

F4(up)：ACAGACGACTGAAGAGATGATTGATGAACT

F4(down)：TATTTTCATATGGAACAAGATTTGTCTATA

(2)将得到的PCR产物进行回收和纯化；

(3)将所得PCR产物通过质粒的构建转化到大肠杆菌进行扩增，再进行抽提测序；

(4)将测序结果输入至DNAMAN与三孢布拉霉正菌crgA基因序列进行比对。

4.权利要求1所述的三孢布拉霉crgA基因在调控类胡萝卜素合成以及提高丝状真菌菌丝体内类胡萝卜素产量方面的应用。

5.根据权利要求3所述的三孢布拉霉负菌crgA基因的克隆方法，其特征在于所述PCR的反应体系总体积为50ul，其中Ex Taq酶0.25uL，Ex Taq Buffer 5uL，dNTP Mix 4uL，从负菌中提取的模板小于1ug，上/下游引物(10uM)各1uL，ddH₂O up to 50ul。

6.根据权利要求3所述的三孢布拉霉负菌的crgA基因的克隆方法，其特征在于所述PCR的反应条件为：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min；72℃后延伸10min。

7.一种含有权利要求1所述的三孢布拉霉负菌的crgA基因的表达载体。

8.一种三孢布拉霉负菌的crgA基因的应用，其特征在于，crgA基因是丝状真菌光诱导类胡萝卜素生物合成过程中的一个关键负调控因子，通过催化类胡萝卜素合成过程其他蛋白泛素化来调控类胡萝卜素的合成。crgA基因的成功克隆及基因序列的确定为提高其他丝状真菌中类胡萝卜素生物合成水平奠定技术基础。