[发明专利]一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法

说明书

本发明提供了一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，本发明所述数字核酸分析方法是以引物标记的磁珠为载体，在乳液中发生滚环扩增反应，磁珠在反应后生成大量的扩增产物并捕捉与之互补的荧光标记引物，形成磁珠‑扩增产物‑荧光标记引物的复合物，反应后的乳液经破乳后收集反应磁珠，使用显微镜和流式细胞仪采集磁珠的荧光信号，通过对荧光磁珠数的计数实现对目标DNA的数字核酸分析。本发明所述的一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法利用滚环扩增的优势缩短了时间、提高了效率，该方法为基因诊断和基因治疗等研究提供了一种工艺简单、信号稳定、具有较高的灵敏度与准确性的数字核酸分析手段。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法。

背景技术

数字化PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作为DNA定量的新技术，实现了单分子DNA绝对定量。dPCR是将单个DNA样品反应液分别进行数以百计的反应，并且每个反应分别进行扩增检测。此技术在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的研究发挥了重要作用。乳液中的PCR是结合了数字PCR以及流式技术，它是基于Bead、Emulsion、Amplificaton和Magnetic这四个主要组分来构建的，称为BEAMing技术。其方法是每一类DNA分子都会专一的与磁性珠子相结合，PCR反应试剂与油相混合形成乳液，得到数以亿计的小液滴。这些小液滴组成独立的反应室，在这个微小且独立的反应室中DNA分子进行扩增反应，扩增后的产物富集在磁珠上，通过离心和磁分离收集磁珠，洗脱后对磁珠上的PCR产物进行测序。该技术可将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应，最后通过流式细胞仪检测评估样品的原始浓度或含量。乳液中进行数字PCR技术的由于PCR反应在乳液中的扩增效率不高，导致磁珠捕获扩增产物进行荧光标记后信号放大效果有限，通常需要对信号进行二次放大等步骤，乳液的形成过程中目标链与磁珠不在同一个液滴里面，存在漏检。PCR技术依赖精良设备，反应温度复杂，对于酶的保真性要求极高，成本高；此外乳液反应完成后破乳收集磁珠，仍需对磁珠进行后续标记处理，不能直接上机测样；PCR反应的所需的高温条件，导致要在标记双生物素来保证其与磁珠结合的稳定性。

发明内容

针对上述技术不足，本发明旨在提出一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，该方法较于乳液PCR有更高的核酸扩增效率和信号放大效果，而且本发明待测的核酸样本无需预先进行PCR扩增，在扩增反应后直接破乳即可上样分析。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，包括如下步骤：

(1)制备滚环扩增引物结合的磁珠；

(2)合成环探针溶液；

(3)捕获环探针：将步骤(1)制备的滚环扩增引物结合的磁珠加入步骤(2)中制备的环探针溶液中，放置于摇床，反应0.5～2h；

(4)制备乳液；

(5)破乳收集磁珠：在反应管中加入异丙醇，破乳洗涤，离心后弃去上清液，收集磁珠；

(6)将步骤(5)收集的磁珠进行显微镜检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数；

(7)将步骤(5)收集的磁珠进行流式检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数。

进一步的，所述滚环扩增引物结合的磁珠是通过如下步骤制备的：

用缓冲溶液洗涤链霉亲和素包被的直径0.5～2μm磁珠，洗涤三次后，将磁珠悬浮在缓冲溶液中，将生物素标记的滚环放大引物加入缓冲溶液中，室温下孵育15～30分钟，然后将磁珠用TE缓冲液洗涤三次。

进一步的，所述环探针是通过如下步骤合成的：