[发明专利]一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法

权利要求书

1.一种乳液中进行滚环扩增的体外非诊断性的数字核酸分析方法，其特征在于：使用挂锁探针、滚环扩增引物P1和滚环扩增引物P2进行滚环扩增，其中：

所述挂锁探针的寡核苷酸序列为：

p-CCA GAT GTA GCT TGT AAG ATG AAG ATA GCG CAC AAT GGT CGAATT CTC AAC CCCTAC GCG AGA CCC AGT AG；

所述滚环扩增引物P1的寡核苷酸序列为：

Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGACCATTGTGCGCTATCTTCA；

所述滚环扩增引物P2的寡核苷酸序列为：

Cy5-ATGGTCGAATTCTCAACCCCTA；

所述滚环扩增包括如下步骤：

(1)制备滚环扩增引物结合的磁珠：

用缓冲溶液洗涤链霉亲和素包被的直径0.5～2μm磁珠，将磁珠悬浮在缓冲溶液中，将生物素标记的滚环扩增引物P1加入缓冲溶液中，室温下孵育15～30分钟，然后将磁珠用TE缓冲液洗涤三次，制得滚环扩增引物P1结合的磁珠；

(2)合成环探针溶液：

将挂锁探针和待测核酸在95℃下孵育3分钟后，然后在52℃、47℃、42℃下各孵育30分钟后将混合物冷却至室温，加入连接酶、连接酶反应缓冲液，反应1～3h，然后灭活连接酶，制得环探针溶液；

(3)捕获环探针：将步骤(1)制得的滚环扩增引物P1结合的磁珠加入到步骤(2)中制得的环探针溶液中，放置于摇床，反应0.5～2h，制得捕获环探针的磁珠；

(4)制备乳液：所述乳液包括水相和油相，其中：

a、水相制备：将步骤(3)中已捕获环探针的磁珠、13μL浓度为20μM的滚环扩增引物P2、20μL浓度为10mM的dNTP、2μL浓度为1mg/mL的BSA、4μL浓度为8UμL^-1的Bst 2.0Warmstart聚合酶混合均匀，加灭菌超纯水至100μL，制得水相；

b、油相制备：将DC5225C、DC749、Ar20以质量比为40％、30％、30％混合均匀，制得油相；

c、形成乳液：将一个直径3毫米钢珠加入2毫升的反应管中，加入100μL水相和200μL油相，调整组织研磨器的频率为28HZ，研磨时间为5分钟，使其形成水相液滴直径约为3-10μm的稳定乳液；

(5)破乳收集磁珠：在制得乳液的反应管中加入异丙醇，破乳洗涤，离心弃去上清液，收集磁珠；

(6)将步骤(5)收集的磁珠进行显微镜检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数；

(7)将步骤(5)收集的磁珠进行流式检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数。