[发明专利]戊型肝炎病毒实时荧光逆转录PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了戊型肝炎病毒实时荧光逆转录PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。本发明针对戊型肝炎病毒，设计和筛选了特异性引物、探针以及含有该引物和探针的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过实时荧光逆转录PCR扩增，进而确认待测样品中是否含有戊型肝炎病毒的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法对戊型肝炎病毒的各个基因型都能够实现快速检测，具有特异性强、灵敏度高、适应范围广、操作简便快捷、检测结果准确可靠、检测时间短的优点，灵敏度达到1×10³copies/mL，解决了传统检测方法耗时长、灵敏度低等问题，特别适合大规模样品的快速检测，为传染源调查、传播环境、病毒来源等工作奠定基础。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及戊型肝炎病毒实时荧光逆转录PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

戊型肝炎(Hepatitiv E)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引发的一种严重危害人类健康的急性传染病。近年来，戊型肝炎发病的绝对数和发病率均呈连续、快速增长态势。因此，提高戊型肝炎的诊断和治疗水平，具有重要的意义。目前，戊型肝炎的诊断方法很多，例如病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应等。其中，聚合酶链式反应(Polymease Chain Reaction(PCR)在理论和应用上取得了突破性的进展，受到业内的高度重视。可是，由于戊型肝炎病毒基因类型比较复杂，在应用PCR方法时，引物设计难度较大，包括引物探针的序列设计与选择、引物/探针用量、镁离子用量、反应条件和阴/阳性对照品等多项技术参数尚缺乏成熟的技术信息，因而还没有形成适应范围大、操作简便、准确可靠的实时检测试剂盒，限制了该方法的推广和普及。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供戊型肝炎病毒实时荧光逆转录PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。

本发明的第一个目的是提供一种戊型肝炎病毒实时荧光逆转录PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：HEV-F1：5’-GTGCTTTTGCCTATGCTG-3’(如SEQ ID NO.1所示)，HEV-R1：5’-GGTTGGTTGGATGAATATAGG-3’(如SEQ ID NO.2所示)。以基因III型戊型肝炎病毒序列(Genebank登陆号为：KU513561.1)为模板，扩增的目的片段的序列如SEQ IDNO.10所示。

本发明的第二个目的是提供一种戊型肝炎病毒实时荧光逆转录PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：HEV-P1：5’-AGAATCAACCCTGTCACC-3’(如SEQ ID NO.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

所述的荧光报告基团优选为FAM，所述的荧光淬灭基团优选为BHQ-1。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述的检测引物和/或检测探针的检测试剂盒。

优选，所述的检测试剂盒包括10×buffer、25mM MgCl₂、10mM dNTP mix、RT-PCRMIX(百泰克)、检测引物HEV-F1和HEV-R1、检测探针HEV-P1、DEPC-ddH₂O、阴性对照品和阳性对照品。

所述的阴性对照品优选为DEPC-ddH₂O。

所述的阳性对照品优选为携带如SEQ ID NO.10所示序列的质粒。