[发明专利]一种敲除PD-1的T细胞制备方法及其应用

说明书

本发明属于生物与新医药技术领域。公开了一种敲除PD‑1的T细胞制备方法，该技术是利用Crispr/Cas9系统来敲除PD‑1基因。本发明还涉及Crispr/Cas9技术修饰的T细胞，所述T细胞表面含有PD‑1蛋白，可与癌细胞表面的PD‑L1蛋白结合，阻碍活化T细胞攻击癌细胞。敲除T细胞中的PD‑1基因，打开了免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能。

技术领域

本发明涉及生物与新医药技术领域，更具体的说，是一种敲除PD-1的T细胞制备方法及应用。

背景技术

PD-1(程序性死亡受体1，programmed death 1)是55KD的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。其胞外区只有1个IgV样区，胞浆区有2个酪氨酸残基，尾部有1个ITIM(immunoreceptor tryosine-based inhibitory motif)。PD-1可表达于活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞，以及CD4-CD8-胸腺细胞。PD-1有两个配体，PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，均为B7家族中的新成员。PD-1是免疫抑制性受体，与其配体PD-L1、PD-L2相互作用传递抑制性信号，在免疫应答中发挥负向调控作用。T细胞上的PD-1与肿瘤细胞中的PD-L1/PD-L2的结合，可抑制活化的T细胞攻击肿瘤细胞，导致免疫系统不能发挥全部作用，使肿瘤细胞逃逸。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器。研究人员发现，它是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼和细菌的基因等。CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。

目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。本研究中使用的就是Crispr/Cas9系统。

由于PD-1蛋白在免疫应答中发挥负向调控作用，使得部分肿瘤细胞逃避T细胞的攻击，造成肿瘤细胞的扩散。敲除T细胞中的PD-1蛋白，可扩大T细胞的攻击范围，增强T细胞的免疫能力。本研究中利用Crispr/Cas9系统，敲除T细胞中的PD-1基因，使其不表达PD-1蛋白，打开免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能。

发明内容

本发明提供了一个利用Crispr/Cas9系统敲除PD-1基因，表达所述Crispr/Cas9系统的T淋巴细胞，以及所述T淋巴细胞用于制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。具体包括：

(1)pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1质粒构建

本发明中提供了一个PD-1的靶点基因，利用该靶点构建pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1载体。

(2)重组病毒表达载体

本发明中使用的载体是慢病毒载体pHBLV-gRNA-cas9-GFP，pHBLV-gRNA-cas9-GFP表达基因载体含有一个Cas9蛋白，一个巨细胞病毒的启动子序列(CMV Promoter)和标签蛋白(GFP)及选择性的抗性基因(AmpR)。通过基因合成的PD-1gRNA序列，即目标靶点，在T4连接酶作用下，与线性RNA敲除载体连接，形成完整载体pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1(载体图谱见图1)。(3)宿主细胞