[发明专利]一种敲除PD-1的T细胞制备方法及其应用

权利要求书

1.一种敲除PD-1的异质T淋巴细胞的制备方法，其特征在于：在PD-1的基因序列中选取19个碱基序列作为靶点，构建pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1质粒，利用慢病毒包装体系将PD-1基因包装到慢病毒中，将携带PD-1基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到敲除 PD-1基因的异质T淋巴细胞；所述19个碱基序列为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的一种敲除PD-1的异质T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下制备：取患者自身的外周血，分离单个核细胞，用含有重组干扰素γ的Lymphocyte Serum-free Medium KBM 551培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素-2和OKT-3诱导继续培养24小时；每隔三天倍比加含有重组白细胞介素-2的培养基，同时加入5％的患者自体血浆，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记 CD3+、CD56+的阳性表达率；当CD3+阳性率＞80％，CD3+CD56+双阳性率＞20％，视为CIK诱导成功，收获患者自体单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，用于慢病毒感染。

3.如权利要求1所述的一种敲除PD-1的异质T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，将所述携带PD-1基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下操作：所述pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1质粒和慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒共同转染293T细胞，所述293T细胞内PD-1基因被包装成慢病毒颗粒，释放到细胞外，收集含有慢病毒的上清，并用收集到的上清感染诱导的异质T淋巴细胞。

4.如权利要求1所述的一种敲除PD-1的异质T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述敲除 PD-1的基因靶点片段通过基因合成技术合成。

5.一种治疗癌症的药物，其特征在于：含有权利要求1中所述的敲除PD-1的异质T淋巴细胞。

6.权利要求1中所述的敲除PD-1的异质T淋巴细胞在制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途。

7.如权利要求6所述的制备治疗恶性肿瘤的药物的用途，其特征在于：所述恶性肿瘤为胃癌，肠癌，胰腺癌，间皮瘤，肺癌，乳腺癌和卵巢癌。