[发明专利]一种高细胞生长密度微藻突变体的筛选方法

说明书

本发明公开了一种高细胞生长密度微藻突变体的筛选方法，包括以下步骤：(1)将抗性基因转化微藻，通过固体平板抗性筛选获得转入抗性基因序列的突变微藻单藻落，收集各个单藻落获得微藻突变体文库；(2)从微藻突变体文库中的每个单藻落取样混合后在液体培养基中培养，并连续传代；(3)每传若干代用抗性基因序列特异性的RFLP分析方法检测，当检测结果显示只剩一种微藻突变体时结束筛选，获得所述高细胞生长密度微藻突变体；当检测结果显示还剩2～5种微藻突变体时，使用固体培养基进行单藻落分离获得所述高细胞生长密度微藻突变体。本发明筛选方法无需高光条件和特殊检测设备，能够快速、简便、高效地完成筛选过程。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种高细胞生长密度微藻突变体的筛选方法。

背景技术

微藻因其具有生长速率快、生长周期短、油脂含量高等特点，被认为是最具潜力的油脂生物能源。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardti)作为研究微藻的单细胞模式生物，已成为潜在的适合大规模生产的能源微藻。但是，莱茵衣藻与其他商业微藻相比生物量较小，较低的生长密度和生物量限制了其作为大规模能源生产的可能。

插入突变是一种常用的突变株筛选方法，已广泛应用于莱茵衣藻特殊表型突变株的筛选。插入的序列一般都含有标记基因，例如AphⅧ(Sizova,I.,Fuhrmann,M.andHegemann,P.(2001) A Streptomyces rimosus aphVIII gene coding for a new typephosphotransferase provides stable antibi-otic resistance to Chlamydomonasreinhardtii.Genetics,277,221-229.)，Ble(Lumbreras,V., Stevens,D.R.and Purton,S.(1998)Efficient foreign gene expression in Chlamydomonas reinhardtiimediated by an endogenous intron.The Plant Journal,14,441-447.)等，便于对突变株进行筛选。

已有研究表明：为提高生物量，降低色素，去除触角等的插入突变株在高光下可达到目的，但在低光照下却不可行。这主要是因为在高光条件下，去触角的细胞会浮在表面获得更多的光照，比野生型可接收到更多的光源。但在低光下无触角的生物量与野生型相比类似，因为此时光照强度在表面和底下相差不大(Polle,J.E.W.,Kanakagiri,S.D.andMelis,A.(2003) tla1,a DNA insertional transformant of the green algaChlamydomonas reinhardtii with a truncated light-harvesting chlorophyllantenna size.Planta,217,49-59.)。尽管高光下可提高衣藻生物量，但强光能耗大，不利于大规模投入使用。因此，如何筛选在普通光照强度下仍具有较高生物量的微藻品系变得更加重要。

发明内容

本发明针对现有技术中缺乏合适的方法来筛选在普通光照强度下仍具有较高生物量的微藻品系的问题，提供了一种高细胞生长密度微藻突变体的筛选方法。

一种高细胞生长密度微藻突变体的筛选方法，包括以下步骤：

(1)将抗性基因转化微藻，通过固体平板抗性筛选获得转入抗性基因序列的突变微藻的单藻落，收集各个单藻落获得微藻突变体文库；

(2)从微藻突变体文库中的每个单藻落取样混合后在液体培养基中培养，并连续传代；

(3)每传代若干次用抗性基因序列特异性的RFLP分析方法检测，当检测结果显示只剩一种微藻突变体时结束筛选，获得一株高细胞生长密度微藻突变体；当检测结果显示还剩2～5 种微藻突变体时，使用固体培养基进行单藻落分离获得高细胞生长密度微藻突变体。