[发明专利]HBV cccDNA的富集提取方法及检测引物组、探针和方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及病毒检测领域，更具体涉及一种HBV cccDNA的富集提取方法和检测HBV cccDNA的引物组、探针和方法。检测引物组为引物组1或引物组2。引物组1由以下4条引物序列组成：引物1：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1；引物2：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2；引物3：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3；引物4：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4。引物组2由以下4条引物序列组成：引物5：其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；引物6：其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；引物7：其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；引物8：其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。和现有技术相比，本发明提供的方法具有更高的准确性、特异性和灵敏性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及病毒检测领域，更具体涉及一种HBV cccDNA的富集提取方法和检测HBV cccDNA的引物组、探针和方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性流行，其感染者已超过二十亿，是我国目前危害最严重的传染病之一。2006年全国乙肝流行病学调查显示，我国目前仍有乙肝表面抗原携带者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万，乙肝和肝癌患者约占全球的四分之一。慢性HBV感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原发性肝癌的主要原因，并且每年导致1百余万人死亡，造成极大的社会危害。

HBV为嗜肝DNA病毒，是引起乙型病毒性肝炎(以下简称“乙肝”)的病原体。细胞外乙型肝炎病毒DNA是一种松弛环状的双链DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)分子，其两条链均不是闭合的，其中负链较长，约3200个碱基，含有乙肝病毒基因组的全长基因，在其5’起始端与3’末端之间有一个数个碱基的“缺刻”(nick)；正链较短，有较大的“缺口”(gap)，其3’末端不固定，故长度是可变的，约为负链长度的50％～100％。在乙肝病毒的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(covalently closed circular DNA，cccDNA)，作为乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板，开始一系列的复制过程。虽然其含量较少，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。HBV复制是一种保守的机制，在转录后模板cccDNA仍然完整，并且可反复转录，所以cccDNA是嗜肝病毒持续感染的关键因素。cccDNA半衰期长，无法从体内彻底清除，临床中有很多经过长期抗病毒治疗完全应答的患者，停止抗病毒治疗后，又常发生HBV再激活和病情复发，主要原因cccDNA的持续存在和难以清除。故cccDNA是HBV复制的突出标志，是评价HBV感染状态及药物疗效最重要的指标。只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的目标。