[发明专利]一种裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养方法

说明书

本发明涉及干细胞培养领域，具体是一种裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养方法，包括以下步骤：1)冲洗裸鼹鼠骨髓；2)骨髓冲出物过细胞筛；3)破除红细胞；4)直接铺板。本发明建立了裸鼹鼠骨髓间充干细胞的分离培养方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性进行了评估，证实该培养方法能够获得纯度很高的有分化能力的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞，从而为进一步深入研究裸鼹鼠干细胞特性以及探讨裸鼹鼠不易分离但可以由干细胞转化的体细胞的特征提供了可能性。

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，具体地说，是一种裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养方法。

背景技术

裸鼹鼠是一种分布于东非部分地区的挖掘类啮齿目动物，在分类学上属于哺乳纲、啮齿目。裸鼹鼠终生在黑暗的地下生活，能够适应低氧环境，并且是啮齿类中寿命最长的动物；对癌症具有超级免疫力。裸鼹鼠长寿、抗衰老、耐低氧、抗肿瘤等特性引起了科学家的广泛关注，针对这些特性的研究成果已发表在Nature、PNAS等著名刊物上。

骨髓间充质干细胞(BMSC)是从骨髓中分离得到的一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。目前虽然已从多种组织中培养出间充质干细胞，但因为骨髓的取材较方便，分离培养简便及含量相对较高，因此骨髓成为间充质干细胞的主要来源。BMSCs不仅可以定向分化为脂肪、软骨、骨骼肌细胞等多种细胞；还可分泌多种促进血管生成因子、凋亡因子等多种具有生物学活性的细胞因子。分离裸鼹鼠间充质干细胞对于裸鼹鼠生物资源的推广应用具有重要意义。由于一些体细胞不太容易分离并体外培养，而成体干细胞可以在特定条件向多种细胞进行转化，因此分离裸鼹鼠间充质干细胞可以为研究裸鼹鼠其他不易分离培养的体细胞的生物学特性提供有力的工具。

目前从骨髓分离获得间充质干细胞的方法主要有直接贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞术和免疫磁珠分离法。流式细胞术和免疫磁珠分离法成本较高，推广范围有限；密度梯度离心法在分离小型动物的骨髓间充质干细胞时获得的细胞活性较低；直接贴壁法获得的细胞活性较高，但是由于红细胞影响目标细胞的贴壁，不适用于红细胞过多的动物。裸鼹鼠体型接近小鼠，适应低氧环境，红细胞含量较高，目前的培养方法不利于获得较高活性和数量的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞。因此，有必要发明一种适合分离培养裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的方法。

发明内容

本发明的目的在于为了推广裸鼹鼠实验动物资源，加强裸鼹鼠体细胞的研究，提供一种裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养方法，包括以下步骤：1)冲洗裸鼹鼠骨髓；2)骨髓冲出物过细胞筛；3)破除红细胞；4)直接铺板。

本发明的第一方面，提供一种裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养方法，包括以下步骤：

A、用洗涤液冲洗成年裸鼹鼠的骨髓腔，获得骨髓冲出液；所述洗涤液的组成为：PBS溶液，加入0.005％-0.02％(W/V)Dnase I；

B、将骨髓冲出液，过细胞筛，制成单细胞悬液；

C、将步骤B得到的单细胞悬液，离心弃上清，收集细胞沉淀；

D、将步骤C得到的细胞沉淀加入1-3mL红细胞裂解液重悬，裂解红细胞1-2min，加等体积终止液，终止裂解，离心后弃上清；所述终止液的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)Dnase I；

E、用培养液将步骤D处理后的细胞沉淀重新制成细胞悬液，按照2×10⁵/cm²接种于培养皿中；所述培养液的组成为：低糖DMEM培养基、10％-20％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)Dnase I；