[发明专利]用于快速检测犬巴贝西虫的荧光定量PCR引物组合、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于快速检测犬巴贝西虫的荧光定量PCR引物组合、试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。本发明针对犬巴贝西虫18S RNA序列设计荧光定量PCR引物组合，该引物的特异性强，不受其他非目的基因干扰，能快速、高效、准确地定性犬巴贝西虫的转录水平及定量犬巴贝西虫的数量。本发明应用荧光定量PCR方法对犬巴贝西虫进行定性检测，方法简单、精确，无管道内污染，无需凝胶电泳，通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化即可获得定量结果，结果重现性好，检测灵敏度高，可用于高通量的样品检测。

技术领域

本发明涉及一种用于快速检测犬巴贝西虫的荧光定量PCR引物组合，同时还涉及包含该引物组合的试剂盒及犬巴贝西虫检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

巴贝西虫病广泛发生于各种家畜，经蜱传播的一种血源性原虫病。其在家畜体内单个或成对寄生于红细胞内，引起严重的贫血和血红蛋白尿症。引起犬的巴贝西虫病的病原体有5种：(i)韦氏巴贝西虫(B.vogeli)，主要通过褐色犬蜱属血红扇头蜱进行传播，其不仅存在于热带和亚热带，在寒冷地区也有分布；(ii)犬巴贝西虫(B.canis)，主要通过革蜱属进行传播，也可以由血红扇头蜱、李氏血蜱等进行传播，仅分布于欧洲；(iii)罗氏巴贝西虫(B.rossi)，主要通过血蜱属蜱虫进行传播，最初仅在南非传播，后来在非洲其他国家(如尼日利亚和苏丹)也发现罗氏巴贝西虫的存在；(iv)Conradae巴贝西虫(B.conradae)，主要分布在美国，其传播媒介还未明确；(v)吉氏巴贝西虫(B.gibsoni)，主要通过长角血蜱进行传播，也可以经血红扇头蜱和镰形扇头蜱进行传播，最初仅分布在亚洲，之后在亚洲以外国家的斗犬品种上也发现过吉氏巴贝西虫。斗犬之间的传播不单单是蜱虫携带感染，有很大一部分是因为携带者和健康犬之间的撕咬斗争而感染。我国主要流行的虫种为吉氏巴贝西虫，该病在国内广泛分布，有蜱滋生的地方，春、夏、秋季均可发病。

目前，血液原虫检测方法主要有涂片染色镜检、临床治疗检测、血清学检测、酶联免疫反应、间接荧光、LAMP技术、多聚酶链式反应(PCR)、荧光定量PCR等。涂片染色镜检法虽然设备简单、操作简便，但是检测率低，易造成漏检。临床治疗检测是对症治疗用杀虫净杀死虫体，易于观察到疗效，但在未表现临床症状的早中期很难发现感染病例，且大多数杀虫药都有较大的毒性，用量过多会对犬的健康造成伤害。血清学检测不能区别是现在感染还是过去感染。LAMP技术虽然简单快速，结果肉眼可以直接观察到，但是易于出现假阳性，且不易鉴定虫体的种类。PCR技术以其较高的特异性和灵敏性被学者认为是检测巴贝西虫的最有效方法。公布号CN102230008A的发明专利公开了一种检测犬巴贝西虫的方法，包括：1)样品DNA的抽提：于待测犬前肢隐静脉取300μL抗凝血，提取DNA待测；2)样品检测：利用犬巴贝西虫特异性PCR引物进行PCR扩增，上游引物F1为：5’-GTAATTCCAGCTCCAATA-3’，下游引物F2为：5’-TTTCGCAGTAGTTCGTC-3’；3)结果判定：反应结束后取5μL PCR产物在2.0％溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察结果，出现大小约为319bp片段的样品即为阳性，判断犬只感染犬巴贝西虫。该方法检测速度快，仅需2小时即可得到结果；检测灵敏度高，样品稀释1000倍仍能检测出虫体DNA的存在；选择性强，不与其他DNA反应。但是该方法的检测速度和检测灵敏度还有待提高。

荧光定量PCR技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术，是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单等优点，不但能够用于基因定量检测，还能准确定量疾病相关基因的表达，现已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、定量分析、早期病原检测、基因分型等方面。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速、准确检测犬巴贝西虫的荧光定量PCR引物。

同时，本发明还提供一种包含上述荧光定量PCR引物的试剂盒。

最后，本发明提供一种快速、准确检测犬巴贝西虫的方法。