[发明专利]基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及高通量筛选领域，具体涉及一种基于串联质谱和分子对接联用的活性多肽高通量筛选方法，为一种以串联质谱鉴定活性部位/成分群中混合多肽序列，利用分子对接筛选活性多肽并验证其活性的方法。

背景技术

活性多肽是指由2～20个氨基酸残基以酰胺键构成，具有一定生理活性的物质，通常分子量不高于2000Da。现代研究表明，活性多肽具有多种生理活性，而海洋来源的活性多肽具有来源丰富，活性显著等特点，近年来受到广泛关注。如从海洋生物中发现的活性肽类物质，如Dolastatin-10、芋螺毒素、鱼皮降压肽等，均表现出重要的市场价值与社会经济效益，越来越多科学家及科研团队将目光转向海洋生物中活性多肽的寻找与开发。

传统的海洋活性多肽的研究主要以活性导向下的系统分离纯化，结构鉴定为主，该方法虽经典，但存在耗时、费力、通量低等缺点。海洋生物中的活性多肽因种类丰富、结构特殊、含量低等特点，目前仍缺乏行之有效的分离、分析、筛选、鉴定解决方案，很难高通量的完成活性物质的筛选与发现。

因此，很有必要在现有技术的基础之上，研究开发出一种快速、高效寻找海洋活性多肽的方法，本发明集成LC-MS/MS快速鉴定混合多肽与计算机高效筛选优化的优势，可从海洋生物(或酶解产物)中快速寻找活性多肽。

发明内容

发明目的：本发明要解决的问题在于：建立一种基于串联质谱与分子对接的海洋活性多肽高通量筛选方法，这种方法既可用于海洋生物中自身存在的初级/次级代谢产物多肽的发现与筛选，亦可用于经过生物酶处理后的混合多肽中活性多肽的发现与筛选，此外，该方法不局限于一种作用靶点的活性多肽的筛选，可应用于多种已知的靶点的活性多肽的发现与筛选。

技术方案，为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)首先对海洋蛤类通进行提取或生物酶酶解，然后分离制备得到总多肽提取物，然后在活性导向下进行活性筛选，确定活性部位；

(2)然后通过LC-MS/MS对活性部位进行质谱分析，将得到的质谱数据通过从头测序分析(de novo sequencing)和/或与蛋白质数据库比对，快速确定蛋白质或多肽的氨基酸序列；

(3)然后通过计算机虚拟筛选，将药物作用靶点与活性物质进行分子对接，从而寻找受体与配体作用的最佳构象，筛选出与受体亲和力最佳的配体，完成高通量多肽的活性筛选，并通过固相合成多肽序列验证其活性。

以上所述的基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法，所述的分离方法包括分级沉淀、分子排阻、离子交换、反相柱层析、疏水层析等。

作为优选海洋蛤类提取物的制备方法有：

将文蛤软体洗净泥沙，加水煎煮，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加水匀浆后，加入生物酶酶解，酶解结束后,于沸水浴灭活，离心，浓缩，得文蛤酶解物。

或者将文蛤软体洗净泥沙，加入3～8倍量60～80％乙醇煎煮1～3次，每次30～60分钟，合并提取液，浓缩后，冷冻干燥，得冻干粉。

将文蛤提取物分离，获得不同部位/成分群，并评价分离获得的不同部位/成分群的活性，确定活性部位/成分群，浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉备用。

其中生物酶包括：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶等。

以上所述的基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法，所述的活性筛选的靶点包括：血管紧张素转化酶(ACE)、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)、凝血酶(thrombin)、乙酰胆碱酯酶(AChE)等。

ACE抑制剂活性评价方法：

ACE与HHL溶液的配制：取适量ACE用0.1mol/L含0.3mol/LNaCl硼酸缓冲液(pH8.3)配成浓度为100mU/mL的ACE溶液；取适量HHL用0.1mol/L硼酸缓冲液(含0.3mol/LNaCl pH8.3)配成浓度为5mmol/L的HHL溶液；

反应过程：将30μLHHL和10μL样品(或缓冲溶液)混匀后，于37℃环境下预热5min(37℃水浴)，再加入20μL的ACE启动反应，混匀后继续于37℃环境下反应1h(37℃水浴)，然后迅速加入70μLHCl(1mol/L)终止反应，用高效液相色谱分析结果。用硼酸缓冲液代替样品溶液做空白对照。