[发明专利]基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法

权利要求书

1.基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)首先对海洋蛤类进行提取或生物酶酶解，然后分离制备得到总多肽提取物，然后在活性导向下进行活性筛选，确定活性部位；

(2)然后通过LC-MS/MS对活性部位进行质谱分析，将得到的质谱数据通过从头测序分析和/或与蛋白质数据库比对，快速确定蛋白质或多肽的氨基酸序列；

(3)然后通过计算机虚拟筛选，将药物作用靶点与活性物质进行分子对接，从而寻找受体与配体作用的最佳构象，筛选出与受体亲和力最佳的配体，完成高通量多肽的活性筛选，并通过固相合成多肽序列验证其活性。

2.根据权利要求1所述的基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法，其特征在于，所述的分离方法包括分级沉淀、分子排阻、离子交换、反相柱层析、疏水层析。

3.根据权利要求1所述的基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法，其特征在于，所述的活性筛选的靶点包括：血管紧张素转化酶、二肽基肽酶-IV、凝血酶或乙酰胆碱酯酶。

4.根据权利要求1所述的基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法，其特征在于，所述的活性部位LC-MS/MS分析方法包括：采用戴安U3000NanoRSLC纳升液相系统，色谱柱为5μm Reprosil C18AQ，上样量为5μL，流速400nL/min，流动相A为体积比为2:0.2:98的乙腈-甲酸-水，流动相B为体积比80/0.2/20的乙腈-甲酸-水，2～30％B线性梯度洗脱60～90min；

Thermo LTQ Orbitrap XL质谱仪用于进行肽段分析，喷雾电压为2.5kV，离子传输毛细管温度为200℃；质谱一级全扫描范围为m/z 100～2000，分离宽度为3Da；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离二级串联质谱，并采用Xcalibur软件进行数据分析，串联质谱数据选择合适的数据库，检索参数设置为：前体离子误差10ppm；子离子误差1Da；半胱氨酸残基固定修饰(氨甲酰甲基化57.0215Da)；甲硫氨酸残基可变修饰(氧化+15.9949Da)；允许2个位点误切，假阳性率≤1％；然后选择不同酶切方式：非酶切(No enzyme)或胰蛋白酶酶切；其它参数为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义，认定为有效的鉴定结果，从而确定活性部位中全部多肽的氨基酸序列信息。

5.根据权利要求1所述的基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法，其特征在于，步骤(3)具体方法为：

根据多肽的氨基酸序列信息进行同源模建：使用Chem BioDraw Ultra 13.0软件绘制各个多肽结构，然后将其导入Discovery Studio 4.0软件中，再使用CHARMm能量场优化并使其能量最小化，利用DS 4.0中的PREPAR LIGAND模块准备配体。

从the Protein Data Bank的数据库中下载蛋白质的晶体结构，作为计算机分子对接的受体模型，使用软件Discovery Studio 4.0中的CDOCKER模块进行分子对接研究，参数为默认设置；经过筛选获得能够与受体结合的配体，确定配体的氨基酸序列，采用固相合成技术合成多肽，采用体外活性评价方法验证其生物活性。

6.基于串联质谱与分子对接高通量筛选杂色蛤中二肽基肽酶-IV抑制剂活性多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)杂色蛤酶解物的制备：

将杂色蛤软体洗净泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次40分钟，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加3倍量水匀浆后，加入酶活性为50000U/g的木瓜蛋白酶酶解，木瓜蛋白酶的加入重量为肉渣重量的1％，酶解的温度为55℃，酶解的pH为7，酶解反应时间为4h；酶解结束后,于沸水浴灭活，然后加入一定量的无水乙醇进行分级醇沉，最终制备30％乙醇沉淀部位1、70％的乙醇沉沉淀部位2及乙醇沉上清液部位3，各部位经浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉。

(2)二肽基肽酶-IV抑制活性评价

将乙醇沉淀部位1、乙醇沉沉淀部位2及乙醇醇沉上清液部位3溶于Tris-HCI缓冲液制成相应的样品液；二肽基肽酶-4、Gly-Pro-PNA分别用Tris-HCl缓冲液配置成8U/L的DPP-4溶液和1.6mmol/L的Gly-Pro-PNA(底物)溶液；

将25μL样品与25μL底物混匀，37℃孵育10min,再加入50μLDPP-4溶液，在37℃孵育1小时，后加入1mol/L醋酸钠缓冲液100μL，405nm处测定吸光度值A，并计算抑制率；同时用Tris-HCI缓冲液代替样品做空白对照；

二肽基肽酶-IV抑制率(％)＝[(A阴性对照-A空白对照)-(A样品-A样品空白)]/(A阴性对照-A空白对照)×100％

(3)活性部位的LC MS/MS分析

活性部位经质谱分析得MS/MS质谱碎片信息，采用非酶切模式进行数据库比对分析，从其中共分析鉴定出多肽氨基酸序列；

(4)多肽氨基酸序列的二肽基肽酶-IV抑制活性分子对接研究

将多肽氨基酸序列同源建模，在Discovery Studio 4.0中进行PREPARE LIGAND，在Discovery Studio 4.0中进行去水、加氢再进行PREPARE PROTEIN，然后将配体与二肽基肽酶-IV靶点进行CDOCKER对接，参数设置如下：Top Hits-10；RandomConformations-10；Orientations to Refine-10；Force field-CHARMm；Use Full Potential-False，其他参数选择默认设置；

经过对接后，确定与二肽基肽酶-IV能够很好对接的多肽序列，表明其为潜在的二肽基肽酶-IV抑制活性多肽；然后通过固相合成技术获得多肽，体外二肽基肽酶-IV活性评价验证。