[发明专利]一种血浆或血清的IgG糖型检测批量前处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物分析领域的糖蛋白糖型检测样品前处理方法，特别涉及血浆(或血清)IgG 2-AB标记的糖型检测批量前处理方法。

背景技术

蛋白质糖基化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式。真核细胞中约有一半的蛋白质发生过糖基化。蛋白质糖基化不仅赋予蛋白质特定的理化性质(如溶解性和稳定性)，更重要的是参与凝血、免疫、细胞生长、分泌和信号传导等生理活动。蛋白质糖基化异常与许多疾病密切相关，比如恶性肿瘤、风湿性关节炎和阿尔茨海默病等。蛋白质糖基化也为肿瘤早期诊断和治疗提供依据，绝大多数临床用肿瘤标记物和蛋白质类药物是糖蛋白。因此，研究蛋白质糖基化不仅可以加深对糖蛋白的生物功能的认识，而且对探讨疾病发生、发现疾病标记物和开发新药具有重要意义。

免疫球蛋白(英文全称，IgG)，又称抗体是一种很重要的糖蛋白，主要分布在血清中。它由两条相同的分子量较小的轻链和两条分子量较大的重链通过二硫键连接而成，抗体的糖链位于重链FC片段上，为N-连接糖。IgG的糖基化对于调节IgG的细胞毒性和抗炎、促炎等炎性潜力非常关键。自身免疫状态和IgG抗体的特定糖基化模式之间的联系已在患类风湿性关节炎和几自身免疫血管炎的患者中被观察到，其中已报道与IgG抗体的降低的半乳糖基化和唾液酸化相关。对IgG糖链结构分析已成为当前研究的热点。陶磊等人(《药物分析杂志》，2011年第11期)分析IgG1型单抗中糖链切除对其结构与功能的影响，结果表明糖链切除后抗体的圆二色谱发生改变，抗原结合能力下降，体外CDC活性基本消失。

然而糖链结构中富含多羟基且基本不含发色团，呈电中性等性质，使得糖类分析非常困难、复杂结构的检测更是异常艰难。因此，需要快速、简单且精确的方式分析糖链结构的技术，并且通过各种方法进行糖链分析。为了进行糖链分析，必须首先从包含在生物样品中分离纯化糖链。一般是将糖蛋白上的糖链切掉并分离纯化后进行分析。因为糖链本身没有发色基团，而且其在质谱仪上不易离子化，为了在分离纯化和结构鉴定过程中能够更有效地检测到糖链，一般进行柱前衍生的方法。该方法主要是对糖链进行标记，使糖链带上紫外或荧光基团，提高检测的灵敏度，同时又可以使糖链带上疏水基团，降低糖链的极性，使糖链在反相色谱柱上得到保留，利于糖链的分离。目前对糖链进行衍生化标记的试剂主要包括2-AB标记衍生糖链的方法。

中国专利申请201410844142.6、发明名称“快速全面检测单克隆抗体N糖基化位点上寡糖的方法”公开了通过酶解反应切除寡糖，然后使用2-AB溶液标记寡糖，纯化寡糖后通过LC-荧光-ESI-MS分析。然而，该方法需要通过氨丙基固相萃取柱进行纯化，过柱纯化步骤复杂并且成本较高，因此不适于批处理切除糖链和2-AB标记及纯化。此外，陶磊等人同时公开了从抗体或蛋白上切除或测定糖链的方法。然而，该方法也需要色谱柱或过柱纯化，导致不能高通量或批处理，因此限制了批处理切除糖链和2-AB标记及纯化。

中国专利申请200610084289.5、发明名称“糖链切除装置”公开了用于从碱溶液中切除糖链的装置，包括反应槽和分离纯化的离子交换柱。然而，该装置只适于从复合碳水化合物中切除糖链，且整个装置包括复杂的构成部件，因此也不适于批处理切除糖链和2-AB标记及纯化。

另外，使用2-AB试剂标记糖链的一般步骤为:(1)通过糖苷酶从糖蛋白切除糖链；(2)对获得的糖链进行纯化；(3)2-AB标记糖链；(4)标记后糖链的纯化，也就是传统的二步纯化法。其中，对于血清或血浆IgG的糖链分析，还需IgG的分离纯化步骤。因此对于血清(或血浆)IgG的糖链分析，相当于需要进行三次糖链纯化，其中在标记之前必须纯化糖链，否则可能出现杂质干扰，导致标记不完全，因此二步法存在步骤繁琐并且可能造成糖链产物的损失。同时，在一些现有技术中，在酶切前需要更换缓冲液，否则导致切糖酶活性变弱，切糖不充分，从而不能保证检测结果的灵敏度和准确度。

因此，目前需要一种能够降低成本、简化步骤，且适用批处理切除糖链和2-AB标记及纯化的方法，该方法应当适用于质谱或色谱检测用的检测平板或微孔板。

发明内容

本发明原理之一在于：本发明不再遵循先纯化糖链后进行标记的传统方法，而是直接进行标记后再进行纯化。由于相对于昂贵的抗体及其糖链样品而言，2-AB试剂更为廉价，因此在确保切除的糖链充分被2-AB试剂标记后再进行纯化，能够有效提高标记效率和产率。