[发明专利]一种血浆或血清的IgG糖型检测批量前处理方法

权利要求书

1.一种从血浆或血清的IgG上批处理切除糖链和纯化的方法，步骤包括：

(1)IgG提取：通过96孔Protein G提取板将血浆或血清IgG提取至2mL96孔收集板中，测定蛋白浓度后，取出250‐350μL IgG溶液于1.1mL 96孔深孔板中整板挥干；

(2)IgG切糖：在深孔板中加入变性剂变性蛋白后调节溶液pH至8.0，加入糖苷酶或切糖酶进行切除糖链；

(3)糖链标记：在挥干的深孔板中加入2‐AB标记溶液，65℃反应3小时，进行2‐AB标记；

(4)标记后纯化：深孔板加入乙腈溶液，上清液转移至96孔糖链纯化板，除去多余的标记试剂，在深孔板中收集洗脱出的被标记糖链，整板挥干；

其中，步骤(2)中变性剂为SDS溶液，并在60℃变性反应10min，或变性剂为Igepal溶液，并在室温变性反应10分钟；以及加入的糖苷酶或切糖酶的质量与蛋白的质量比为1:50～1:30；

步骤(3)中，每孔加入的标记溶液为0.5mg的2‐AB和1.2mg的氰基硼氢化钠，并且所述2‐AB和氰基硼氢化钠预先配制在含30％乙酸的DMSO溶液中；

步骤(4)中，去除多余标记试剂所用清洗液为96％的乙腈溶液，洗脱标记的糖链为超纯水。

2.权利要求1的方法，其中步骤(1)中还包括IgG提取板前处理、IgG结合和清洗、IgG洗脱、IgG提取板再生和保护。

3.权利要求2的方法，其中所述IgG提取板前处理方法为：

①用2毫升超纯水清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；

②用2毫升1×PBS清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；

③用1毫升0.1M甲酸溶液清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；

④用2毫升10×PBS进行板子的中和‐真空泵抽滤，去除废液；

⑤用4毫升1×PBS平衡板子‐真空泵抽滤，去除废液。

4.权利要求3的方法，其中所述IgG结合和清洗方法为：用2毫升1×PBS清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液，再重复2次。

5.权利要求4的方法，其中所述IgG洗脱的方法为：

①用1毫升0.1M甲酸溶液洗脱IgG‐真空泵抽滤，收集洗脱液；

②向收集板中加入170μL中和缓冲液，并用枪头混匀；

③用锡箔纸将收集板盖好，放在震荡器轻微摇晃，避免交叉污染，直至检测样品浓度。

6.权利要求5的方法，其中所述IgG提取板再生和保护的方法为：

①用2毫升0.1M甲酸溶液清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；

②用2毫升10×PBS清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；

③用4毫升1×PBS清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；

④加入1毫升存储缓冲液‐真空泵抽滤，去除废液，其中存储缓冲液为20％乙醇溶于20mMTris+0.1M NaCl；

⑤加入1毫升存储缓冲液，4℃保存。

7.权利要求6的方法，其中步骤(1)中血浆或血清样本量为50μL，使用前用pH为7.4的1×PBS稀释7倍，Protein G提取板为96孔Protein G提取板，IgG收集为96孔收集板；蛋白浓度测定所用仪器为nano‐drop蛋白浓度测定仪，测定波长为280nm，IgG的摩尔吸光系数值为2.534×10⁵；以及，

其中步骤(2)中，SDS溶液浓度为1.33％，Igepal溶液浓度为10％，pH调节剂为0.1M NaOH和5×PBS的混合液，加入的切糖酶为PNGase F酶，所述Igepal为(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇‐辛基苯基‐聚乙烯二醇。

8.权利要求6的方法，其中步骤(4)中，纯化标记后的糖链的纯化板为0.22μm的亲水性96孔板，纯化过程包括清洗、洗脱过程，其中，清洗过程包括：

①每个样品中加入700μL 100％乙腈，用枪头混匀并全部转移到纯化板中，孵育两分钟，真空泵抽滤，去除废液；

②在纯化板的每个孔中加入200μL96％乙腈‐真空泵抽滤，去除废液，重复四次；

③将纯化板放在1毫升或2毫升收集板上，每个孔中加入200μL96％乙腈；

④1000转/分钟，离心5分钟。