[发明专利]一种尿激酶的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于尿激酶纯化技术领域，具体涉及一种尿激酶的分离纯化方法。

背景技术

尿激酶(简称UK)是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物尿中，人尿平均含量5-6iu/ml。它是一种丝氨酸蛋白酶，能够特异性的识别纤维蛋白溶酶原，并催化其转变成纤维蛋白溶酶。此酶可使不溶的纤维蛋白分解成可溶的小肽，从而使血栓溶解。因此，临床上UK常被用于溶解血栓，预防和控制心肌梗死、高血压、动脉硬化等。尿激酶有多种分子量形式，主要以两种形式存在，一种是高分子量(54700，HUK)尿激酶，另一种是低分子量(31300，LUK)尿激酶。两种分子量形式的UK的作用机制相同，并且对合成底物N-乙酞甘氨酞-L-赖氨酸甲脂(简称AGLME)有相同的动力学常数。但由于HUK对纤溶酶原的亲合力较LUK高，而且在血液中的半衰期长，溶栓效果是LUK的2-3倍，所以研究制备高比活大分子的HUK的纯化方法更有实际意义。

目前，从发表的专利和文章来看，从尿液中提取尿激酶主要有3种方法：(1)发泡法，即以高速搅拌使酶液发泡，然后使泡沫液化，加入硫酸铵使尿激酶沉淀；(2)沉淀剂法，在尿液中加入沉淀剂，使尿激酶沉淀，尿激酶则保留在沉淀中；(3)吸附剂法，此法应用最多，选择适当的吸附剂，有选择的吸附尿激酶，如724树脂法，文献《用大孔离子交换树脂从人尿中提取尿激酶》公开了利用羧酸型阴离子交换树脂从人尿中提取尿激酶的方法。所得尿激酶的回收率为85％，比活达573.0IU/mg。

对于尿激酶的纯化，则主要采用层析柱方法进行分离纯化，如文献《亲和层析法纯化尿激酶》即公开了一种以琼脂糖凝胶为载体，对氨基苯甲脒为配基，采用亲和柱纯化尿激酶的方法，该方法中尿激酶的活性回收率为62.96％。该方法特异性强、纯化效果好，但酶的活性回收率低，远无法满足临床需要。

中国专利申请2015107824933《一种尿激酶分离纯化方法》即公开了一种利用凝胶柱纯化尿激酶的方法。该方法避免使用强酸强碱，能有效分离内毒素，同时保证尿激酶不被破坏，分离效果能达到药典标准要求，收率在97％以上，但该方法只能除去粗品中的内毒素，但大小分子尿激酶的比不到60％，无法满足临床应用的需要。

发明内容

为了提高尿激酶的比活性和收率，本申请的目的是提供一种尿激酶的分离纯化方法，该方法包括如下步骤：

1)尿激酶粗品的制备

2)尿激酶的纯化

所述的步骤2)包括如下步骤：将步骤1)制得的尿激酶粗品溶解后的澄清液经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱进行纯化。

优选地，所述步骤2)中澄清液的尿激酶浓度为(2×10⁶-5×10⁶)IU/L。

优选地，所述步骤2)中澄清液以60-100mL/min的速度流经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱；进一步优选为80-100mL/min；原因在于，速度低于60mL/min或超过100mL/min均会影响纯化得到的尿激酶的比活性。

优选地，所述步骤2)中澄清液与柱体积比为(15-20)：1。

优选地，所述步骤2)中澄清液经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱后利用0.2-0.3MNaCl、PH6.5-7.5的磷酸缓冲液进行洗脱。所述步骤2)中澄清液经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱包括：①所述澄清液至少一次经葡聚糖微球柱或琼脂糖微球柱纯化；②所述澄清液至少一次依次经葡聚糖微球柱和琼脂糖微球柱纯化；③所述澄清液至少一次经葡聚糖微球和琼脂糖微球混合柱纯化。

进一步优选地，所述步骤1)尿激酶粗品的制备方法，具体步骤如下：

a)男性尿液，在10℃以下，调节pH8.5，静置2小时，弃去沉淀，得上清液；

b)取上清液，调pH5.0-5.5酸化，得酸化尿，通过硅藻土柱进行吸附；

c)5℃冷水洗柱，以0.02％氨水、0.2-0.5M氯化钠溶液进行洗脱，得洗脱液1；

d)洗脱液1于pH4-5的条件下上CM-C柱，然后用PH11.5-11.8的氨水和0.2-0.5M氯化钠溶液进行洗脱，得洗脱液2，洗脱液2冻干即得尿激酶粗品。

进一步优选地，步骤1)尿激酶粗品的制备方法，具体步骤如下：

a1)男性尿液，调节pH6.0-6.9，加入724树脂进行吸附，吸附完全后用PH6.5-6.8的5％NaCl溶液进行洗脱，得洗脱液X；

b1)洗脱液X经pH2.5的20％NaCl溶液盐析，沉淀、离心后得盐析物1；