[发明专利]一种蛋白自组装新型纳米疫苗及其制备方法

说明书

本发明涉及一种蛋白自组装新型纳米疫苗及其制备方法，基于抗原蛋白自组装制备而成，在疫苗制备过程中选择性引入分子佐剂，抗原含量≥85％，无需铝佐剂、弗氏佐剂等辅助即可引发高效免疫效应，利用物理调控暴露蛋白分子间的巯基，通过巯基/二硫键交换反应，形成以二硫键交联为主的稳定的蛋白纳米粒。本发明克服了传统纳米疫苗需引入外源载体或交联剂等缺陷，可同时提高疫苗的免疫效应及生物安全性。所得到的疫苗颗粒形貌规整，稳定性强，调控方式灵活，重复性好，可高效刺激树突细胞成熟。具有较强的通用性、普适性，在一系列的抗原蛋白上得到验证，在疫苗新方法及生物制药领域具有潜在重大应用价值。

技术领域

本发明属于高分子纳米生物医药材料领域，尤其是涉及一种蛋白自组装新型纳米疫苗及其制备方法，基于大分子抗原蛋白分子调控，通过内部巯基交联、蛋白再折叠或自组装的方法将抗原肽或免疫佐剂载入蛋白，形成高密度纳米疫苗。

背景技术

疫苗保护人类免受诸多致命性疾病的侵袭，是人类历史上最成功的医疗措施，如在全世界范围内根除了天花并且有效地减少了其它一些烈性的传染病感染，例如：脊髓灰质炎、白喉、破伤风、百日咳、麻疹、腮腺炎以及风疹病毒的感染等，在改善了人类的生活质量的同时，更是大大延长了人类的平均寿命。根据美国国立卫生研究院2010年的统计数据显示，疫苗每年至少减少了250万例死亡与难以计数的其他病例。

传统的疫苗设计采用病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、脱毒、灭活等方法制成疫苗，其缺点在于如果病原体灭活不彻底，会导致生物安全风险。当前的传统疫苗主要是指灭活苗和弱毒苗，但也存在着很难解决的弊端。如，常规疫苗生产成本高，需要佐剂和多种免疫接种方式才能引起有效地免疫保护，并且容易受到母源抗体的干扰，而对新生幼畜具有很低或没有免疫保护作用。类毒素可以引起体液免疫应答但是不产生或产生很少的细胞免疫应答；灭活苗中不能引起免疫应答的部分不仅对预防传染没有作用，反而有可能减弱能引起免疫反应部分产生的免疫保护作用。灭活苗中还含有对机体有害的物质，例如，内毒素等。活疫苗存在致病力并且有污染的风险，一般说来，灭活苗安全但和活疫苗相比其产生免疫保护的时间短并且保护力弱。而活疫苗中存在致病毒株和其它病原体的风险非常高。弱毒疫苗既可以产生体液免疫又能产生细胞免疫，但是弱毒疫苗仅适用于少数病原和免疫力低下的动物。

亚单位疫苗是利用微生物表面的一种或多种保护性抗原诱发机体产生保护性免疫应答，但亚单位疫苗通常免疫原性较弱，需要添加佐剂来增强免疫原性，例如经FDA批准的铝佐剂及弗氏佐剂。但是，已有许多人对铝佐剂的安全及质量问题提出了质疑，如：铝佐剂不能冻干，制备的疫苗批与批之间差异大，质量难控制且对佐剂的效果很难做出准确的评价；主要刺激Th2相关抗体的产生，只能诱导产生体液免疫应答；增加发生超敏反应的危险。

核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防或治疗疾病目的。有案可查的动物用DNA疫苗包括：马西尼罗病毒疫苗、人用HIV DNA疫苗等。由于DNA疫苗可能存在与机体细胞基因组DNA发生整合的担忧，一些疫苗学家可能对其应用于人体持谨慎态度。

纳米疫苗作为一种新型纳米疫苗，是目前疫苗领域的一大热点。纳米颗粒作为抗原与佐剂的递送工具和免疫增强剂被广泛应用，不仅提高了抗原、佐剂的稳定性，增强抗原的递呈效率和免疫原性，促进抗原胞内加工，可与主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibility Complex，MHC)分子特异性结合；同时也能够靶向递呈抗原，具有缓释功能；重要的是，许多纳米颗粒自身具有免疫佐剂活性，可高效增强机体免疫应答。然而，纳米载体如纳米乳剂、脂质体、胶束、PLGA、硅纳米粒、金纳米棒等，也带来了很多问题，如抗原与佐剂负载效率低、载体在疫苗组分中占比过高；抗原与佐剂的颗粒内包封使得抗原的表面多展示近似于无；动物或人体内产生了针对纳米颗粒的抗体，例如PEG是获得公认的生物相容性良好的生物材料，但却被发现机体内产生了针对PEG的抗体；纳米载体的毒性与体内代谢问题也没有得到很好的解决。