[发明专利]一种基于全准同重二乙基标记的蛋白质定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种整体蛋白质分子的定量方法，尤其是涉及一种基于全准同重二乙基标记的蛋白质定量方法，属于与生物质谱相关的系统生物学、蛋白质组学等技术领域。

背景技术

近几年来，带高效解离模式的高质量测量精度、高质量分辨质谱仪(如轨道阱质谱仪)得到了快速发展和普及；这使得蛋白质的质谱的串级质谱分析和高可信度定性鉴定成为了可能。不同生理或病理条件下蛋白质研究和分析同时需要准确度高的定量方法。同位素标记定量，因为能有有效克服方法和系统误差，一般比非标定量要准确。在同位素标记中，通常有同位素、同重和准同重三种模式；准同重模式因为使用不同重同位素标记的、质量仅有细微差异(mDa)的同一个碎片离子的相对峰强度进行相对定量，不仅能最大限度地克服方法和系统误差，而且能有效同重模式下来自共囚禁前体离子的干扰。

基于SILAC的体内同位素标记^1-3和基于TMT的体外同重标记⁴，由于靶向氨基酸的非完全标记(如重的赖氨酸或精氨酸在SILAC中的非完全替代)和非靶向氨基酸的非选择性标记(如苏氨酸的TMT标记)，其应用范围受到了比较大的限制。二甲基(同位素、同重、准同重)标记由于其试剂易得，标记效率高，在蛋白质和多肽定量方面得到了广泛的研究和应用。我国科学家在这个定量技术方面也做出了巨大的贡献，发展了多种不同形式的二甲基标记^5-8；其中申请人首次将全准同重二甲基标记(universal pseudo-isobaric dimethylation)引入到完整蛋白质的定量分析，N端氨基酸上的氨基和赖氨酸残基上的氨基的“一锅式”全标记有效避开了后者的额外预保护及其相关副反应，大大提高了定量分析的效率和准确度⁸。申请人自己开发的完整蛋白质数据库搜索引擎ProteinGoggle(http://proteingoggle.tongji.edu.cn/)^9-11能自动将二甲基基团作为动态修饰加到任意位置的赖氨酸上，从而使得全标记成为可能。ProteinGoggle是基于申请人发明的同位素轮廓指纹比对算法(isotopic envelope fingerprinting,iEF)¹²开发的；iEF算法直接在原始数据上进行匹配离子的搜索和蛋白质的鉴定。该算法无需对实验数据进行“去同位素”预处理，可以节省相应的时间；根据各个离子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相对强度的偏差对理想及非理想实验数据进行很好的区分，保证蛋白鉴定的可信度；根据已知重叠离子的同位素峰相对强度关系对重叠实验数据进行有效的解析。基于该算法申请人成功地开发了整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle，在单个标准蛋白(泛素、肌红蛋白)及整体蛋白质组混合物(组蛋白H4家族翻译后修饰异构体、大肠杆菌)的定性鉴定中，表现出较高的可信度和较好的应用前景。在定量分析方面，ProteinGoggle有着它内在的和独特的潜在优势；一方面基于同位素轮廓及其中每个同位素的指纹比对可以快速精确地搜索同位素或同重标记的定量离子对；另一方面，搜索过程中每个离子中每个同位素峰的实验强度都被记录和输出，可以用来直接计算相对定量比。

在准同重二甲基标记定量中，N端第一个氨基酸的a1离子因为峰强度高而通常用作定量的碎片离子。加上二甲基基团的28Da，a1离子的质荷比范围在58-187Da之间；a1离子是二级质谱中最小的碎片离子。为了保证较好的检测a1，一般要设定一个比a1离子小一些(比如10Da)的二级质谱最低检测质量。由于离子阱只能对最低检测质量15倍以内的碎片离子进行很好的囚禁，这使得碎片离子的检测范围比通常使用的2000要小得多；也就是说，最低质量端的a1离子的检测使得高质量端的离子得不到很好的囚禁和检测，从而对蛋白质的鉴定产生较大的影响。

参考文献

1 Waanders,L.F.,Hanke,S.&Mann,M.Top-down quantitation and characterization of SILAC-labeled proteins.Journal of the American Society for Mass Spectrometry 18,2058-2064,doi:10.1016/j.jasms.2007.09.001(2007).