[发明专利]一种提高烟草芦丁含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高烟草芦丁含量的方法，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

芦丁(Rutin)是一类特殊的黄酮醇类化合物，具有较高的抗氧化活性，可起到抗癌作用，且有效降低高血压和高血脂的风险。芦丁的来源现主要为槐米，芦丁含量可达10%~28%，可槐米产量，尤其是其中芦丁含量受气候、采收、晾晒条件等影响较大，导致槐米售价不稳定。随着我国人民生活的提高，对芦丁以及其制成的药品需求不断增加，拓宽芦丁来源物种，开发不同组织（如叶片、籽粒等）提取物，筛选高芦丁含量品系等都将成为有效的手段。

烟草在中国广泛种植，生物量较大（150-200kg/公顷），且采收容易，这些有特点使烟草具有更广阔的应用前景。除制成烤烟之外，现在已开展了一些针对烟草食用及药用价值的研究，如烟草蛋白含量远高于大豆，成为食品工业中蛋白的又一优质来源。目前，已有利用杂交及转基因技术改良烟草品质的报道，但仍主要集中在改良烤烟品质、降低焦油含量等方面。目前，我国对禁烟的规定越来越严格，人们群众对健康的要求越来越高，在此背景下，针对烟叶品质改良及提升烟叶在烤烟以外的应用价值尤显重要。

发明内容

为解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种利用转基因技术转化烟草，提高烟草芦丁含量的方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为一种提高烟草芦丁含量的方法，按照以下步骤进行操作，

a、利用克隆技术，从富含芦丁的苦荞中克隆得到一个MYB类转录因子；

b、利用植物过表达载体对MYB类转录因子进行构建，在MYB类转录因子基因的PCR引物序列中内嵌了Sma I 和Sac I酶切位点，直接选择 Sma I 和 Sac I 对 MYB类转录因子基因进行双酶切处理。

优选的，所述步骤b中植物过表达载体为pBI121-35S。

优选的，所述步骤b中MYB类转录因子基因的PCR引物序列为

MYB类转录因子F（5’to3’）：TCCCTCAACATGGGAAGACCTCCT

MYB类转录因子R（5’to3’）：CTGTTTAGAACAGATCATCGGCGG。

优选的，所述步骤b在酶切处理时，采用37°C金属浴 45min。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果： 本发明采用从苦荞中克隆到的一个MYB类转录因子，通过农杆菌介导法提升烟草内源芦丁含量，无需外源喷施化学试剂诱导（刺激）；转基因T0代植株即可实现芦丁含量的增加，方法成熟，周期短，见效快，成本低。

附图说明

图1为本发明中表达载体构建扩增引物示意图。

图2为本发明中载体构建的图谱。

图3为本发明转基因烟草的培育过程图。

图4为本发明中转基因烟草PCR鉴定的示意图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一种提高烟草芦丁含量的方法，其特征在于：按照以下步骤进行操作，

a、利用克隆技术，从富含芦丁的苦荞中克隆得到一个MYB类转录因子，其中MYB类转录因子有两种，分别命名为FtMYB7和FtMYB9；以FtMYB7为例，FtMYB9的做法相同。

b、利用植物过表达载体pBI121-35S:FtMYB7对FtMYB7进行构建，在FtMYB7基因的PCR引物序列中内嵌了Sma I 和Sac I酶切位点，直接选择 Sma I 和 Sac I 对 FtMYB7 基因进行双酶切处理，37°C金属浴 45min。

其中，步骤b中FtMYB7基因的PCR引物序列为

FtMYB7F（5’to 3’）：TCCCTCAACATGGGAAGACCTCCT

FtMYB7R（5’to 3’）：CTGTTTAGAACAGATCATCGGCGG。

FtMYB9F(5′to 3′)：GCTCTAGAGAGACATGGGAAGGGCTCCTTGT

FtMYB9R(5′to 3′)：CGAGCTCGTGAGATAATCAGATGAGCAAAG