[发明专利]靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体

说明书

本发明公开了一种靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，并将其应用于嵌合抗原受体T细胞的构建与制备，而后在体外实验中验证了嵌合抗原受体T细胞肿瘤治疗效果。靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体由前导肽、靶向人CD19抗原的单链抗体、连接ScFv所用的铰链区、跨膜结构域和免疫受体酪氨酸活化基序组成，将该嵌合抗原受体构建成慢病毒表达载体，然后感染免疫细胞，能够在免疫细胞表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体，通过识别肿瘤细胞表面的CD19抗原，从而杀死表达CD19抗原的肿瘤，实现肿瘤治疗目的，为肿瘤靶向治疗提供了新的工具。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及抗人CD19抗原人源化单克隆抗体设计，还涉及表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体，以及慢病毒表达载体的制备方法和应用。

背景技术

单克隆抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质联合，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。以小鼠来源单克隆抗体用于疾病治疗，直接使用小鼠抗体进行人体治疗时，因为鼠抗的异质性会引起人抗鼠抗体反应(Human anti-mouse antibody reaction，HAMA)，导致抗体半衰期短，在循环系统中被很快清除，失去疗效。因此，治疗用鼠源单抗需要进行人源化修饰以提高抗体的人源化程度、减弱HAMA。人源化抗体就是指抗体的可变区部分(即VH和VL区)或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应，人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为人源化抗体。

将鼠源抗体改造为人源化抗体有以下几种主要形式：鼠可变区(Viarableregion，VRs)+人恒定区(Constant region，CRs)、鼠互补决定区(Complementaritydetermining region，CDRs)+人框架区(Fragment regions，FRs)、鼠CDRs+人FRs等，尤其以“鼠CDRs+人FR”模式最为常见，这种人源化抗体形式仅仅保留了CDRs中的鼠源残基，而将其余部分替换为人抗残基，能将鼠抗的异源反应降到较低水平。但是直接将鼠抗CDRs移入人抗FRs通常会导致抗体失去原有抗原结合活性，因此需要对影响抗原抗体结合的关键残基进行反复修改，而后通过大量抗原抗体结合特异性、亲和力检测，从而筛选得到具有活性的抗体序列。传统人源化改造方案大多基于小鼠抗体与人抗体的序列同源性分析。

过继细胞治疗(Adoptive cell therapy，ACT)是生物治疗技术的一种，通过对自体免疫细胞(主要是T细胞)进行体外扩增，然后将其回输给肿瘤患者以达到治疗目的的方法，被认为是继手术、放、化疗后的第4种癌症治疗方式，在临床治疗中受到广泛应用。过继细胞治疗技术主要包括：淋巴因子活化的杀伤细胞(Lymphokine activated killer cell，LAK)与IL-2联合治疗晚期恶性肿瘤取得了一定疗效；肿瘤浸润淋巴细胞(Tumorinfiltrating lymphocytes，TIL)，治疗转移性黑色素瘤取得了较好的临床效果；细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer cell，CIK)对肝癌、肺癌等肿瘤取得了显著的效果。但是目前上述三种治疗方法均需活化T细胞。T细胞活化需要两种活化信号，即T细胞表面的TCR-CD3与MHC-I分子结合产生活化的第一信号，决定T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；T细胞表面的共刺激分子与相应配体结合产生活化的第二信号，决定T细胞增殖。但肿瘤细胞在肿瘤微环境中可下调自身MHC、配体分子的表达，从而抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。因此需要对T细胞进行基因改造，使其重新获得对肿瘤细胞的杀伤能力。目前这种改造主要有两种方式：基因转导TCR(T cell receptor，TCR)和嵌合抗原受体(Chimericantigen receptor，CAR)。