[发明专利]一种球囊霉素的提纯方法

说明书

技术领域

本发明涉及土壤提取物纯化技术领域，具体涉及一种土壤中球囊霉素的提纯方法。

背景技术

球囊霉素是目前为止发现的唯一一种丛枝菌根真菌分泌到土壤中的一类糖白质，能够和单克隆抗体(MAb32B11)发生免疫性荧光反应，且非常稳定，难溶于水，只有用偏碱性的柠檬酸钠溶液才能提取得到。球囊霉素由N连接而成，分子量约为355KD，由3％～5％N、36％～59％C、4％～6％H、33％～49％O和0.03％～0.1％P组成，有些还含有0.8％～8.8％Fe。球囊霉素还属于一种热激蛋白，其蛋白序列与一种线粒体基质热激蛋白HSp 60的序列高度同源(>80％)。

最初的球囊霉素的提取方法为考马斯亮蓝法，其原理是：除球囊霉素蛋白以外的所有非热稳态蛋白在浸提过程中都能够被破坏。根据这一原理球囊霉素被分为总球囊霉素(TG)、易提取球囊霉素(EEG)、免疫反应性总球囊霉素(IRTG)和免疫反应性易提取球囊霉素(IREEG)。最近，GRSP被分成3种：易提取球囊霉素相关土壤蛋白(EE-GRSP)、难提取球囊霉素相关土壤蛋白(DE-GRSP)和总球囊霉素相关土壤蛋白(T-GRSP＝EE-GRSP+DE-GRSP)。大量的研究已经证实，球囊霉素能够提高水稳性团聚体的含量和土壤团聚体的稳定性，改善土壤理化性状，在保护、恢复和重建生态系统中发挥重要作用。球囊霉素也够能固定土壤中的碳和氮，是土壤有机碳库的重要组分。球囊霉素还具有非常重要的胶结功能，它能够与重金属元素结合，并通过吸附、隔离作用，过滤重金属或者降低重金属的生物可利用性。此外，球囊霉素还可以提高植物的抗旱性。

球囊霉素的定量研究涉及提取和定量测定两个方面，一般提取球囊霉素通常采用Wright和Upadhyaya描述的方法，通过不同的提取条件可分别获得易提取球囊霉素和总提取球囊霉素；球囊霉素的定量测定则采用考马斯亮蓝G-2500染色或者酶联免疫法(ELISA)对提取液中的球囊霉素含量进行定量。整个方法的关键步骤就是从土壤中获得球囊霉素提取液，因为其球囊霉素的含量及特异性直接影响后续的研究。然而，一系列研究指出，应用Wright和Upadhyaya的方法提取的球囊霉素并非AM真菌的专性分泌物，不能确定为真正意义上的球囊霉素。之后也有不少研究者对球囊霉素的提取方法进行改进，但仍是无法从土壤中获得纯度较高的相关蛋白，这严重限制了人们研究其在土壤中的分布及环境功能。因此，本发明提供一种土壤中球囊霉素的提纯方法。

发明内容

有鉴于此，本发明针对从土壤中提取球囊霉素的传统方法并不是专性的方法，不能去除球囊霉素以外的所有非热稳态土壤蛋白，从而无法得到高纯度球囊霉素的问题，提供了一种土壤中球囊霉素的提纯方法，该方法能去除球囊霉素以外的所有非热稳态土壤蛋白，得到高纯度的球囊霉素。

本发明提供的一种球囊霉素的提纯方法，步骤包括：

S1、采集土壤表面0-20cm的黄壤，混匀风干，过孔径4mm的网筛去除土壤中杂质；

S2、取步骤S1所得土壤，加入20mmol/L，pH为7的柠檬酸钠溶液，振荡30～60s，后于100-105kpa，120-125℃条件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，分别收集上清液及沉淀；

S3、将步骤S2所得上清液于100-105kpa，120-125℃条件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，收集上清液，重复提取、离心、收集上清液的过程多次至上清液的颜色不再是红棕色，即得液态的易提取球囊霉素；

S4、取步骤S2所得沉淀，加入50mmol/L，pH为8的柠檬酸钠溶液，振荡至沉淀均匀散开，再于100-105kpa，120-125℃条件下提取55-65min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，收集上清液，重复提取、离心、收集上清液的过程多次至上清液的颜色不再是红棕色，即得液态的难提取球囊霉素；

S5、取步骤S1所得土壤，加入50mmol/L，pH为8的柠檬酸钠溶液，振荡30～60s，后于100-105kpa，120-125℃条件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，收集上清液，重复提取、离心、收集上清液的过程多次至上清液的颜色不再是红棕色，即得液态的总提取球囊霉素；