[发明专利]基于叶绿素荧光成像的转基因玉米草甘膦耐受性表型的检测方法

权利要求书

1.一种基于叶绿素荧光成像的转基因玉米草甘膦耐受性表型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)种植同等数量的转基因玉米和非转基因玉米，在玉米生长过程中，对一部分数量的转基因玉米和非转基因玉米喷施浓度为1080g a.e.ha^-1的草甘膦溶液作为实验组，对剩余的转基因玉米和非转基因玉米喷施等量的水作为对照组；

(2)通过制定莽草酸标准曲线结合紫外分光光度法，获得受草甘膦胁迫不同天数的转基因玉米和非转基因玉米的植株冠层叶片的莽草酸含量；

(3)应用叶绿素荧光成像系统，获取受草甘膦胁迫不同天数的转基因玉米和非转基因玉米的植株冠层的荧光参数；

(4)采用主成分分析，选择对草甘膦胁迫响应最敏感的叶绿素荧光参数；

(5)通过k-means方法在实验组和对照组内选择建模集和预测集；

(6)以建模集内样本选择的叶绿素荧光参数作为输入，莽草酸含量作为输出，建立转基因玉米莽草酸PLSR回归分析模型；

(7)将预测集内样本的叶绿素荧光参数输入所述转基因玉米莽草酸PLSR回归分析模型，得到对样本的莽草酸含量。

2.如权利要求1所述的基于叶绿素荧光成像的转基因玉米草甘膦耐受性表型的检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，分别种植120盆转基因玉米和非转基因玉米，其中转基因玉米转入cry1Ab/cry2Aj-G10evo基因，在玉米生长至3叶期时，将草甘膦溶液置于便携式CO₂高压喷雾器中，分别对80株转基因和非转基因玉米植株进行喷施作为实验组，喷施压力为23lb pol^-2，喷施量为120L ha^-1；在同等条件下，分别对40株转基因和非转基因玉米植株喷施等量的水作为对照组；

在喷施后的第2、4、6、8天取转基因玉米和非转基因玉米各20株，喷施水的转基因玉米和非转基因玉米各10株进行实验，共有实验样本240个。

3.如权利要求1所述的基于叶绿素荧光成像的转基因玉米草甘膦耐受性表型的检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，测定实验样本莽草酸含量的步骤有：

(2.1)获取莽草酸提取物：每个样本取0.1g叶片加入1.5ml的0.25mol/L的HCl提取液在冰浴状态下迅速碾磨，于12000r/min离心10min，收集离心上清液；

(2.2)测定莽草酸提取物的OD值：取200μl的离心上清液加入微量滴定板上，加入2ml浓度为1％的高碘酸，3h后，加入2ml的1mol/L的NaOH溶液，再加入1.2ml的0.1mol/L的甘氨酸，混匀后放置5min，在紫外分光光度计380nm下比色，记录OD值；

(2.3)测定莽草酸标准品的OD值并绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线：将sigma莽草酸标准品10mg溶于1.5ml0.25mol/LHCL中，取0、1、2.5、5、10μl加入0.25mol/LHCL至1.0ml，用上述OD值，绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线，并计算得到每个样本的莽草酸含量。

4.如权利要求1所述的基于叶绿素荧光成像的转基因玉米草甘膦耐受性表型的检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，所采用的叶绿素荧光成像系统包括两对LED光源，其中一对提供红橙色的光化光，强度为120μmol photons m-2 s-1；另一对在800ms的白色波长中提供饱和脉冲，为强度高达1400μmol photons m-2 s-1的冷白光；

在测定叶绿素荧光前，被测样本需要暗适应30分钟；黑暗适应后测叶绿素荧光参数Fo和Fm，用连续光化光照射植物92秒，获得5个饱和脉冲。