[发明专利]用于生产糖蛋白的动物细胞株及方法、糖蛋白及其用途

说明书

本发明涉及用于生产糖蛋白的动物细胞株及方法、糖蛋白及其用途，本发明的用于生产以高甘露糖型糖链为主要N‑糖链结构的糖蛋白的动物细胞株的特征在于，所述细胞株的高尔基体甘露糖苷酶基因和内质网甘露糖苷酶基因中的至少两种基因被破坏或敲除。根据本发明，可以获得具有复合型糖链含量大大降低、以Man9‑GlcNAc2和Man8‑GlcNAc2等高甘露糖型N‑糖链为主要结构的糖蛋白。本发明生产的以高甘露糖型糖链为主要N‑糖链结构的糖蛋白可用于生产包含溶酶体酶，抗体等生物药物分子，从而能够用于治疗各种溶酶体贮积症。

技术领域

本发明涉及用于生产糖蛋白的动物细胞株及方法、糖蛋白及其用途，具体而言涉及用于生产以高甘露糖型糖链为主要N-糖链结构的糖蛋白的动物细胞株、使用该动物细胞株进行糖蛋白生产的方法，利用所述动物细胞株生产的糖蛋白以及该糖蛋白的用途。

技术背景

糖蛋白是生物体中一类重要的功能性蛋白，从结构上讲，糖蛋白是分支的寡糖链与多肽链共价相连所构成的复合糖，其中寡糖链与多肽链的连接方式主要分为以下几种类型：Asn残基结合型(也称为N-糖苷键型)、 O-Ser/Thr型、GPI锚定型和蛋白聚糖型。本发明主要涉及具有N-糖苷键型糖链(也称为N糖链)的糖蛋白(俗称N-糖)的生产。N-糖苷键型糖链具有五糖核心，主要包括三类寡糖链：①高甘露糖型，由GlcNAc和甘露糖组成；②复合型：除了GlcNAc和甘露糖外，还有果糖、半乳糖、唾液酸等；③杂合型，同时包含①和②的特征。其中，高甘露糖型糖链是糖蛋白转运进哺乳动物细胞如人类细胞的溶酶体的标记，已发现该糖链被除去后糖蛋白不再能发挥其固有活性。

溶酶体中含有多种水解酶，这些水解酶大部分是带有糖链的糖蛋白，它们可以将蛋白、粘多糖、糖脂等物质消化为小分子，提供细胞再次回收利用。这些水解酶在内质网中合成，在高尔基体内进行糖链的修饰，然后通过特定的M6PR受体的识别被转运至溶酶体中(见图1(a)、(b))。高尔基体中糖链的修饰往往是通过在核心糖链的Man的6位上添加UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)的N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸酯部分 (GlcNAc-1-P)，产生Man-6-P-1-GlcNAc，然后将GlcNAc的部分除去，形成具有酸性糖链的糖蛋白，然后通过特定的M6PR受体的识别被转运至溶酶体中。

当产生的水解酶因为代谢通路异常无法正常运送至溶酶体或者是因控制该溶酶体酶的基因发生突变，该酶反应链中的中间产物不能正常降解而在溶酶体中贮积，从而引起细胞组织器官功能的障碍，导致溶酶体贮积症的发生(见图1的(c))。例如，法布莱病的病人由于缺少α半乳糖苷酶，使得糖脂，特别是一种中间产物globortriaosylceramide(Gb3)无法被分解而蓄积在细胞的溶酶体中，从而威胁着他们的生命。目前对于溶酶体贮积症主要的疗法有：酶替代疗法、化学疗法、基因水平上的基因修饰疗法等，而其中最为经典的方法即为酶替代疗法(见图1(d))。由于细胞膜表面存在M6PR，M6PR可以识别药物蛋白上的糖链结构并将蛋白带到溶酶体，从而能够通过M6PR用正常的水解酶替代自身损伤的水解酶，使溶酶体贮积症得到改善。

但是，酶替代疗法的应用仍然受到很大限制，例如现有的用于酶替代疗法的药物：目前市售的针对法布莱病的药物Genzyme公司的Fabrazyme (β-半乳糖苷酶)和Shire HGT公司的Replagal(α-半乳糖苷酶)，它们的效果并不能令人满意，而对于大多数溶酶体贮积症来说，还尚未有有效的治疗方法。

因此，提供针对各种溶酶体贮积症的有效的治疗方法是目前迫切需要解决的课题之一。