[发明专利]一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法，属于医学动物模型研究领域。

背景技术

近年来，交通及施工事故的日益频发，常会出现骨折或骨缺损伤害，迫切需要金属材料的植入以固定骨折断裂处，以利于患者骨折恢复。然而，这类材料在植入时，由于手术操作不当或材料灭菌不彻底，易导致细菌引入，从而引发感染。而这类感染特别难以控制，最终引发植入体细菌感染，从而导致植入手术失败。据美国国家卫生研究院 (National Institutes of Health) 统计分析，80 %的人体植入物失效是由细菌感染导致的。细菌会在人体植入装置上粘附增殖，形成生物被膜。细菌在生物被膜的保护下能抑制抗菌药物进入被膜内，抗菌药物无法与细菌接触，故表现为对抗生素的耐受性；另一方面，细菌生物被膜能有效的保护细菌免受宿主免疫系统稽查。细菌在免疫系统薄弱时或抗生素作用过后从生物被膜释放出来，利用现在的有机质作为营养物质，迅速增殖扩增，从而导致感染的复发，这就是植入体细菌感染久治难愈的原因。

怎样模拟人工假体材料体外细菌感染所致手术病患者的细菌感染，是目前医学领域研究的一个难点和重点，也可以更好的研究人工假体材料体外染菌所致感染发病机制，为这类感染治疗提供可行性方案。现采用新西兰大白兔作为实验动物，模拟这类感染产生以及研究这类疾病所导致的动物临床症状，为后期人工假体材料体外染菌所致的细菌感染提供动物实验模型以及检测指标。

本发明以大白兔慢性骨髓炎动物模型为模板，探索了实用可行的人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型。实验操作大致流程为：首先模拟人工假体材料体外染菌过程；然后，在兔胫骨干骺端处制造骨缺损；随后，植入假体染菌材料，手术缝合创口。所有兔子术后均检测体重、体温以及血液中白细胞数量变化情况，并同时观测动物体征情况。一周后将实验动物处死，进行微生物和组织病理学检测。

发明内容

本发明的目的是建立一种实用、可行的动物染菌模型，为后期人工假体材料体外染菌所致的细菌感染提供动物实验模型以及检测指标。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法，包括以下步骤：

（1）动物的选择及饲养条件：挑选新西兰大白兔在室温通风条件下饲养与实验；

（2）菌种的选择及培养：首先用接种环轻挑斜面金黄色葡萄球菌加入到15 mL营养肉汤培养基中，培养至细菌达到中等浓度。然后，在无菌条件下通过划线方法接种于营养琼脂板上，再用接种环挑取单个菌落，接种于15 mL新的营养肉汤培养基中。其后，将菌管放入恒温摇床中培养，此时细菌处于稳定生长期。次日，采用麦氏比浊法，用新鲜营养肉汤培养基调节细菌浓度；

（3）麻醉：动物麻醉之前称量体重，配合使用戊巴比妥钠和速眠新麻醉剂对动物实施麻醉。给药同时观察肌肉紧张程度，角膜反射情况，当上述反应较弱时或消失时即完全麻醉；

（4）人工假体材料体外染菌过程的模拟：取棒状钛金属经无菌处理后，置于500 μL无菌（Eppendorf，EP）管内，浸没于步骤（2）制备的金黄色葡萄球菌（S. aureus）溶液中，其后将含有菌液和材料的EP管放在恒温培养箱中培养；

（5）动物染菌模型建立：将新西兰大白兔麻醉成功后，自右胫骨干骺端纵行切开，显露胫骨近侧干骺端，经骨钻造孔至骨髓腔。从钻孔处注入鱼肝油酸钠注射液，后将步骤（4）所得浸泡菌液后的材料植入胫骨缺损处，骨蜡封闭，手术缝合；

（6）术后动物观察：待实验新西兰大白兔麻醉清醒后单笼饲养，笼内自由活动空间合适，饲养标准均统一，术后不使用任何抗菌药物；

（7）动物染菌模型的评价：观察新西兰大白兔的大体情况，进行血液常规指标检测、微生物学检测、病理组织观察。

作为优选，步骤（1）所述新西兰大白兔为雄性，3只，体重2.0±0.5 kg，3~4月龄。

作为优选，步骤（2）所述金黄色葡萄球菌（S. aureus）购于美国模式培养物集存库（ATCC）；所述培养均是在32~37℃之间置于100~300 rpm的恒温摇床中培养；所述菌管放入恒温摇床中培养的时间为1~12 h；所述接种于营养琼脂板上的时间为15~24 h。

作为优选，步骤（2）所述调节细菌浓度至1×10⁶~1×10⁸ CFU/ mL之间。