[发明专利]一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法

权利要求书

1.一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）动物的选择及饲养条件：挑选新西兰大白兔在室温通风条件下饲养与实验；

（2）菌种的选择及培养：首先用接种环轻挑斜面金黄色葡萄球菌加入到营养肉汤培养基培养，至细菌达到中等浓度，然后，在无菌条件下通过划线方法接种于营养琼脂板上，再用接种环挑取单个菌落，接种于新的营养肉汤培养基中，将菌管放入恒温摇床中培养，此时细菌处于稳定生长期，次日，采用麦氏比浊法，用新鲜营养肉汤培养基调节细菌浓度；

（3）麻醉：新西兰大白兔麻醉之前称量体重，配合使用戊巴比妥钠和速眠新麻醉剂对动物实施麻醉，给药时观察肌肉紧张程度，角膜反射情况，当肌肉紧张程度与角膜反射情况较弱或消失时即完全麻醉；

（4）人工假体材料染菌过程的模拟：棒状钛金属经无菌处理后，置于无菌离心管内，浸没于步骤（2）制备的金黄色葡萄球菌溶液中，其后将含有菌液和材料的EP管放在恒温培养箱中培养；

（5）动物染菌模型建立：将新西兰大白兔成功麻醉后，固定于手术台上，沿小腿胫骨内侧至膝关节周围剃毛，采用碘伏溶液对手术区域皮肤消毒，自右胫骨干骺端纵行切开，显露近侧干骺端，经骨钻造孔至骨髓腔，而后放出少量骨髓，从钻孔处注入鱼肝油酸钠注射液，后将步骤（4）所得浸泡菌液后的假体材料植入胫骨缺损处，骨蜡封闭，手术缝合；

（6）术后动物观察：待实验新西兰大白兔麻醉清醒后单笼饲养，笼内自由活动空间合适，饲养标准均统一，术后不使用任何抗菌药物；

（7）动物染菌模型的评价：观察新西兰大白兔的体征情况，进行血液常规指标检测、微生物学检测、病理组织观察。

2.根据权利要求1所述的一种模拟人工假体材料体外染菌所导致大白兔感染的动物模型构建方法，其特征在于，步骤（1）所述新西兰大白兔为雄性，3只，体重2.0±0.5 kg，3~4月龄。

3.根据权利要求1所述的一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法，其特征在于，步骤（2）所述金黄色葡萄球菌购于美国模式培养物集存库ATCC；所述培养均是在32~37 ℃置于100~300 rpm的恒温摇床中培养；所述菌管放入恒温摇床中培养的时间为1~12 h；所述接种于营养琼脂板上的时间为15~24 h。

4.根据权利要求1所述的一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法，其特征在于，步骤（2）所述调节细菌浓度至1×10⁶~1×10⁸ CFU/ mL。

5.根据权利要求1所述的一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法，其特征在于，步骤（3）所述戊巴比妥钠麻醉剂的质量浓度为1~5%；所述戊巴比妥麻醉剂的用量为0.5~1 mL/kg新西兰大白兔。

6.根据权利要求1所述的一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法，其特征在于，步骤（4）所述人工假体材料体外染菌过程的模拟包括如下步骤：选用医用级棒状钛金属作为人工假体材料，经800目、1000目、3000目、5000目砂纸顺次打磨光滑后，再依次放入丙酮、乙醇、去离子水中超声清洗，人工假体材料经高温高压灭菌、干燥后置入无菌EP管内与20~50 µL 1×10⁶~1×10⁸ CFU/ mL的金黄色葡萄球菌菌液混合，并使菌液浸没假体材料，在32~37℃ 20~80 rpm条件下恒温培养1~3 h。

7.根据权利要求1所述的一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法，其特征在于，步骤（5）所述鱼肝油酸钠注射液的质量浓度为1~5 %。

8.根据权利要求1所述的一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法，其特征在于，步骤（5）所述动物染菌模型建立包括如下步骤： 将新西兰大白兔麻醉成功后，固定于手术台上，沿小腿胫骨内侧至膝关节周围剃毛，采用碘伏溶液对开窗区域皮肤消毒，自右胫骨干骺端纵行切开长为10 mm的切口，逐层分开皮肤、筋膜、软组织，剥离骨膜，显露胫骨近侧干骺端，经骨钻造直径为3 mm小孔至骨髓腔，而后放出少量骨髓，从钻孔处注入100 µL 5%质量浓度的鱼肝油酸钠注射液，5 min后将浸泡菌液后的材料植入胫骨缺损处，骨蜡封闭，从里到外依次缝合筋膜、皮肤。

9.根据权利要求1所述的一种模拟人工假体材料体外染菌所致大白兔感染的动物模型构建方法，其特征在于，步骤（7）所述动物染菌模型的评价包括：

动物体征：包括大白兔的饮食、体重、白细胞数量变化情况、活动情况、肢体肿胀程度及伤口愈合的情况；

血液常规指标检测：兔耳缘静脉取血，进行血常规检测；

微生物学检测：实验兔子均作骨髓组织的细菌培养，将兔子处死，无菌条件下取胫骨标本称重，然后，将骨髓腔内组织置于无菌生理盐水内，进行10倍浓度梯度稀释，取原液和稀释液进行血平板涂布，第二天进行细菌计数，然后，将血平板生长的菌落挑取出来进行革兰氏染色和血浆凝固酶实验，分别鉴定细菌种类以及是否具有致病性；

病理组织观察：随机选取造模成功的动物，处死后取胫骨干骺端标本，置于4 %体积浓度多聚甲醛溶液进行组织固定，固定后取出标本，再流水冲洗，按照以下过程对标本进行脱钙、石蜡包埋处理：以乙二胺四乙酸脱钙液处理样本，用石蜡包埋脱钙后的标本，粗修包埋后的样本，在切片机上制备组织薄片，然后将组织薄片贴片干燥，其后，进行H&E染色和Masson染色，最后，在光学显微镜下观察，进行组织学评价。