[发明专利]重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法

说明书

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌发酵产物中L‑哌啶酸的分离提纯方法。本发明是以全细胞催化制备L‑哌啶酸的发酵液为原料，经脱色、去除杂质和溶析结晶得到针状晶体L‑哌啶酸。本发明的分离提纯方法将等电点结晶和溶析结晶结合，采用了丙酮作为溶析剂，解决了L‑哌啶酸在水中溶解度大，不容易析出的问题，提纯的L‑哌啶酸，光学纯度可以达到百分之百；且该方法操作简单，对环境污染小，收率高，可达94.9％，而且所需试剂简单，可以通过设计新型装置达到循环利用，为工业生产L‑哌啶酸提供一种新方法。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法。

背景技术

哌啶酸(Pipecolic acid，简称PA)是一种重要的刚性环状非蛋白质氨基酸，它既可以限定多肽的构象，还可作为不同化合物合成库中的多功能骨架，所以广泛用于许多手性药物和生物活性物质的制备。新一代局麻药罗哌卡因(Ropivacaine)、抗精神病药物硫利哒嗪(Thioridazine)、免疫抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)以及抗肿瘤抗生素山卓霉素(Sandramycin)等，均是以哌啶酸或其衍生物为主要原料制得的。

由于哌啶酸及其衍生物具有的生物活性和广泛的应用前景，其合成已引起众多国外研究者的兴趣，并开发出许多合成的新方法和新技术。利用重组大肠杆菌生产手性L-哌啶酸是一种新型生产哌啶酸的方法，其具有产率高选择性高光学纯度高等优点。哌啶酸及其衍生物作为一类应用广泛的医药中间体，市场需求会越来越大。若将上述生物合成哌啶酸的方法转为工业生产，L-哌啶酸分离提纯技术也很重要。随着合成技术、生物技术及药学研究的不断发展，可以预期哌啶酸及其衍生物必定具有更为广泛的应用前景。

目前分离提取有机酸的方法主要有：钙盐法、沉淀法、萃取法、离子交换法、膜分离法。钙盐法是一种传统的从发酵液中提取有机酸的方法，但此法收率低，操作过程中存在损失过多问题，而且会产生大量废弃物，对环境造成严重污染。萃取法采用有机溶剂经行萃取，此过程中采用大量的毒性有机溶剂，残留的毒性溶剂会对产品质量造成影响，并且存在着溶剂回收处理的问题。申请号为200810195852.5的专利采用阳离子树脂交换提取发酵液中琥珀酸，但琥珀酸发酵液中的大量杂质离子会导致树脂污染严重，交换容量迅速下降，而且树脂的频繁再生会产生大量废液，造成严重的环境污染。申请号为200610086003.7的专利利用膜分离、活性炭脱色及结晶技术从厌氧发酵法制备的发酵液中分离提取琥珀，但膜的清洗加大了劳动强度，而且50℃脱色及65℃和-0.08～0.1MPa下的减压蒸发浓缩，会导致大量的能耗。

目前为止有关L-哌啶酸分离纯化的国内外文献资料相对较少，因此开发一种光学纯度高、操作简单、成本低、对环境污染小、收率高的从重组大肠杆菌发酵产物中分离提纯的L-哌啶酸的方法在工业生产中具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法，本发明的分离提纯方法将等电点结晶和溶析结晶结合，采用了丙酮作为溶析剂，解决了L-哌啶酸在水中溶解度大，不容易析出的问题；且该方法操作简单，对环境污染小，收率高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法，包括以下步骤：

1)待分离样品处理：取发酵原液，加入吸附剂充分混匀后加热搅拌，再经滤纸、硅藻土和滤膜过滤，得澄清溶液；

2)杂质去除：将步骤1)所述的澄清溶液，加入溶剂后充分混匀，再经静置、离心，取上清液；

3)溶析结晶：将步骤2)所述的上清液调节pH值至6.0～6.5，加入丙酮静置溶析，离心后析出白色晶体后进行抽滤烘干，得针状晶体L-哌啶酸，抽滤得到的滤液循环到下一次溶析结晶。