[发明专利]一种检测低丰度基因突变的方法

说明书

本发明涉及低丰度基因突变的检测。特别地，本发明提供了一种通过自淬灭探针熔解曲线分析的检测待测核酸样品中的核酸分子是否存在突变的方法。此外，本发明还提供了包含自淬灭探针和引物组的试剂盒，所述试剂盒可用于实施本发明的方法。

技术领域

本发明涉及低丰度基因突变的检测。特别地，本发明提供了一种通过自淬灭探针熔解曲线分析的检测待测核酸样品中的核酸分子是否存在突变的方法。此外，本发明还提供了包含自淬灭探针和引物组的试剂盒，所述试剂盒可用于实施本发明的方法。

背景技术

基因突变是指DNA分子在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，是一种可遗传的变化，在自然界各物种中普遍存在。细菌在复制繁殖过程中会发生随机突变，某些突变会导致细菌对药物产生抗性，这些突变称为耐药突变。在基因诊断中，检测细菌的耐药突变，尤其在异质性耐药(同时存在敏感菌和耐药菌)样本中检测出低比例的耐药突变，对鉴定耐药患者，指导个体化用药具有重要的意义。例如，在结核分枝杆菌耐药诊断中，作为金标准的传统药敏试验可以检测到1％的耐药菌，但目前的分子方法均无法检测出1％的耐药突变(Folkvardsen D B et al,2013,J.Clin.Microbiol.51(5):1596-9)。再有，肿瘤基因突变多是发生在实体瘤中的体细胞突变，表现为混杂有大量正常野生型基因组的稀有突变，其低比例突变直接影响到靶向药物的治疗效果。因此，在大量野生型基因组背景下检测出低比例突变尤为重要。

虽然有多种分子检测方法，但是在灵敏度和简便性上还无法达到满意的要求。许多检测基因组DNA低频突变的方法是利用聚合酶链式反应(PCR)来扩增突变型和野生型靶序列，扩增产物可用多种方法进行分析，包括测序，限制性酶切、质谱或者等位基因特异探针杂交等方法均可实现从野生背景下鉴定突变型。由于这些方法以相同的扩增效率扩增野生型和突变型模板，加上方法本身的分辨率较低，灵敏度不足以检测低频突变。例如，sanger测序作为分子检测方法的“金标准”，但是在大量野生背景下只能检测出10-20％的突变型。膜杂交方法是利用固定在膜条上特异性野生型探针和突变型探针与PCR产物杂交显色，也只能检测出5％的突变型。

COLD-PCR是指在低变性温度下，富集突变型基因组，扩增产物可用于后续测序检测，大大提高突变检出率。在COLD-PCR的基础上，有研究发展了TT-COLD-PCR用于降低COLD-PCR对于温度的敏感性(Castellanosrizaldos,E.,Liu,P.,Milbury,C.A.,et al.(2012).Clinical Chemistry,58(7),1130-8)，ice-COLD-PCR技术(Milbury C A,Li J,Makrigiorgos G M.2011.Nucleic Acids Research,39(1):50-60)引入寡核苷酸“夹子”压制野生型基因组，可更有效地富集突变型基因组，E-ice-COLD-PCR(How K A,MazaleyratN,Daunay A,et al.2013.Human Mutation,34(11):1568–1580)使用LNA修饰的“夹子”，压制野生基因组扩增，富集突变，效果优于ice-COLD-PCR。这些方法需要结合测序进行检测，提高了检测突变的选择性，降低假阴性，但是仍需PCR后处理，操作繁琐，并容易造成污染。

扩增阻碍突变系统(ARMS)，利用等位基因特异性突变引物进行PCR，引物的3’端与突变型模板匹配，引物得以延伸，而野生型模板与引物的3’端不匹配而无法延伸。但是，ARMS技术只能针对已知突变，对引物的设计要求较高，容易出现假阳性的结果，且难以实现多重检测，反应管数较多。