[发明专利]一种检测低丰度基因突变的方法

权利要求书

1.一种用于非诊断目的的检测核酸样品中的待测核酸分子是否存在突变的方法，其包括以下步骤：

1)提供至少一种自淬灭探针，所述自淬灭探针与野生型核酸分子的待检区域完全互补，并且所述自淬灭探针与野生型核酸分子所形成的双链杂交体的熔解温度Tm1高于其与存在突变的核酸分子所形成的双链杂交体的熔解温度Tm2；

2)提供包含第一引物和第二引物的引物组，所述引物组既能扩增野生型核酸分子，又能扩增存在突变的核酸分子，且扩增的产物包括所述自淬灭探针与核酸分子的杂交区域；所述第一引物与所述自淬灭探针与待测核酸分子的同一条链杂交，并且，在杂交时，所述第一引物位于所述自淬灭探针的上游，且两者不重叠；

3)将待测核酸分子与步骤1)中所述的自淬灭探针和步骤2)中所述的引物组混合，并进行PCR扩增和熔解曲线分析；和

4)根据熔解曲线分析的结果来判定待测核酸分子是否存在突变；

其中，在步骤3)中，所述PCR扩增的延伸温度介于Tm1和Tm2之间；并且，采用不具备5’→3’核酸外切酶活性的耐热核酸聚合酶进行PCR扩增；

所述核酸样品中的所述存在突变的核酸分子以低丰度存在。

2.权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，所述PCR扩增的退火温度低于第一引物和第二引物的Tm值。

3.权利要求1所述的方法，其中，在步骤(3)中，进行不对称PCR扩增。

4.权利要求3所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述第二引物相对于第一引物而言是过量的。

5.权利要求3所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述第二引物相对于第一引物而言过量至少2倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，至少15倍，或至少20倍。

6.权利要求3所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述第二引物相对于第一引物而言过量过量10-20倍。

7.权利要求1所述的方法，其中，所述Tm1值高于所述Tm2值至少5℃，至少8℃，至少10℃，或至少15℃。

8.权利要求1所述的方法，其中，所述不具备5’→3’核酸外切酶活性的耐热核酸聚合酶是KlenTaq。

9.权利要求1所述的方法，其中，所述存在突变的核酸分子在所有待测核酸分子中的比例不高于50％，不高于40％，不高于30％，不高于20％，不高于10％，不高于5％，不高于1％，不高于0.5％，不高于0.1％，或不高于0.01％。

10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述待检区域包含疾病相关基因、耐药相关基因或毒力基因。

11.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述突变为单个碱基的转换或颠换。

12.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述自淬灭探针不具备抵抗DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性的修饰。

13.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述自淬灭探针包含能够增强探针结合能力的核苷酸类似物。

14.权利要求13所述的方法，其中，所述核苷酸类似物选自锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)。

15.权利要求13所述的方法，其中，所述自淬灭探针在与存在突变的核酸分子发生错配的位点上的核苷酸替换为所述核苷酸类似物。

16.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述自淬灭探针的5’末端标记荧光基团，其3’末端标记淬灭基团。