[发明专利]一种广谱溶菌酶的高通量筛选方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域的一种广谱溶菌酶的高通量筛选方法。该方法包括以下步骤：A，将目标溶菌酶的基因突变文库在真核细胞中进行分泌表达，获得含不同活性目标溶菌酶的发酵液；B，将含不同活性目标溶菌酶的发酵液分别加入到反应体系中进行反应，筛选出对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶；其中，反应体系包括：胞内表达“供体荧光蛋白‑蛋白酶的识别位点‑受体荧光蛋白”的革兰氏阴性菌、蛋白酶和蛋白酶反应缓冲液。本发明所述筛选方法通过FRET荧光蛋白对与位点特异性蛋白酶的级联，显著提高了检测的灵敏度；同时该方法可利用荧光酶标仪和96微孔板实现溶菌酶的高通量检测。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种广谱溶菌酶的高通量筛选方法。

背景技术

溶菌酶(lysozyme，EC3.2.1.17)又称胞壁质酶(muramidase)，能特异性水解原核细菌细胞壁中的主要成分肽聚糖，分解微生物的细胞壁，使细菌失去细胞壁的保护并在胞内高渗透压的作用下破裂死亡，从而达到杀菌目的。1921年，著名英国细菌学家AlexanderFleming在人的鼻液中发现了溶菌酶，后证实溶菌酶广泛存在于鸟类和禽类的蛋清内、哺乳动物的各器官组织和体液内、植物以及软体动物和昆虫体内。

溶菌酶作为高等有机体组织及体液中最强大的抗菌剂之一，是生物机体对抗外源病原菌侵袭的重要防御因子。如人溶菌酶是一种小分子碱性球蛋白，它由上皮细胞和单核-巨噬细胞分泌，可识别和破坏病原菌的细胞结构，并通过信号级联反应吸引白细胞集中到感染部位，最终消灭侵染人体的病原菌。此外，溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，和DNA-RNA脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。在植物中，如无花果的鲜汁中均含有丰富的溶菌酶，推测其与植物的抗病毒作用密切关系。另一方面，溶菌酶也广泛存在于微生物中，如各种细菌和噬菌体。噬菌体溶菌酶与噬菌体侵染过程中细菌细胞壁的分解有关。细菌溶菌酶的主要功能是参与细胞生长分裂形态改变等与细胞壁相关的代谢过程。因此，细菌不会对溶菌酶这种细菌中广泛含有的自溶素(autolysin)，产生真正意义上的抵抗性，这对于解决日益严峻的细菌耐药性问题，减少抗生素滥用具有重要意义。

虽然溶菌酶的作用强大，但其对革兰氏阴性菌的裂解效果并不好。这是由于细菌细胞壁构成不同所导致的。革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖构成，肽聚糖层数较多且较厚，含有少量磷壁酸，而革兰氏阴性菌外层主要由脂多糖(LPS)构成，内层才含有少量肽聚糖。而溶菌酶的主要作用位点为细胞壁中的肽聚糖，水解β-1,4糖苷键，故其对于革兰氏阴性菌的作用效果不是很理想。

在日常生活当中，人们所接触到的很多致病菌，如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎杆菌、痢疾杆菌和产气荚膜杆菌等，都属于革兰氏阴性菌。为了得到对革兰氏阴性菌具有高杀菌活性的溶菌酶，可以对溶菌酶进行定向进化，构建溶菌酶基因随机突变文库，再从中筛选出对革兰氏阴性菌杀菌效果较强的溶菌酶。

定向转化过程中，一方面，所需的突变体文库数量庞大，需采用高通量方法以提高筛选效率；另一方面，溶菌酶对革兰氏阴性菌裂解效果差，需采用衡量指标较敏感、可有效反映裂解效果的筛选手段。而现有的筛选方法如平板抑菌圈法、牛津杯法等，无法很好的同时满足以上两点要求。因此，亟需构建一种灵敏可靠、易操作的高通量筛选方法，用于广谱溶菌酶突变体的筛选。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种广谱溶菌酶的高通量筛选方法，该方法通过FRET荧光蛋白对与位点特异性蛋白酶的级联使用，提高了检测的灵敏性，同时利用荧光酶标仪和96微孔板可以实现溶菌酶的高通量检测。

为此，本发明提供了一种广谱溶菌酶的高通量筛选方法，其包括以下步骤：

A，将目标溶菌酶的基因突变文库在真核细胞中进行分泌表达，获得含不同活性目标溶菌酶的发酵液；

B，将含不同活性目标溶菌酶的发酵液分别加入到反应体系中进行反应，筛选出对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶；