[发明专利]一种广谱溶菌酶的高通量筛选方法

权利要求书

1.一种广谱溶菌酶的高通量筛选方法，其包括以下步骤：

A，将目标溶菌酶的基因突变文库在真核细胞中进行分泌表达，获得含不同活性目标溶菌酶的发酵液；

B，将含不同活性目标溶菌酶的发酵液分别加入到反应体系中进行反应，筛选出对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶；

其中，所述反应体系包括：胞内表达“供体荧光蛋白-蛋白酶的识别位点-受体荧光蛋白”的革兰氏阴性菌、蛋白酶和蛋白酶反应缓冲液；所述供体荧光蛋白与受体荧光蛋白之间的距离在10nm以内；

根据反应过程中供体荧光蛋白的信号强度增长速度，判断发酵液中的溶菌酶对革兰氏阴性菌杀菌活性；

所述的蛋白酶为具有识别序列特异性的蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶为TEV蛋白酶、肠激酶或凝血因子Xa。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶为TEV蛋白酶。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述TEV蛋白酶的识别位点的氨基酸序列为：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标溶菌酶基因突变文库的构建方法为易错PCR和/或DNA改组。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供体荧光蛋白与受体荧光蛋白之间的距离在10nm以内时，供体荧光蛋白的能量转移至受体荧光蛋白上。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的供体荧光蛋白为青色荧光蛋白，所述的受体荧光蛋白为黄色荧光蛋白。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真核细胞为毕赤酵母。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

C，对筛选出的对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶进行复筛，根据反应过程中供体荧光蛋白的信号强度增长速度，验证溶菌酶的活性。