[发明专利]一种噬菌体止血剂的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，涉及了一种噬菌体止血剂的制备方法及其应用。

背景技术

血液凝固通指血液由流动的液状变成不能流动的凝胶状态的过程，主要是凝血因子促使血浆中可溶性纤维蛋白原变成不可溶的纤维蛋白的过程。正常的血液循环中存在的凝血和抗凝血系统能够相互平衡，从而保证了血液的正常流动。当机体因受到外力打击而出现伤口时，血液中的凝血因子、血小板可以为微小创伤(如轻微割伤)上的伤口迅速止血。重组凝血因子，如凝血因子VII，是一种是传统的人血凝血因子，是全身用止血药的代表，但该凝血因子具有分子量大、生产成本高、价格昂贵、半衰期短(4～6h)、表达量低、不易保存等缺点，大大限制了其在意外事故的急救治疗、手术过程中的创伤、战场上的受伤出血等应用。目前，临床上多采用化学药物如维生素K、酚磺乙胺、氨甲苯酸、重组人白介素-11等来作为止血剂来加速血液的凝固。这些止血药物主要是通过促进凝血因子活性或者抑制纤维蛋白溶解或者促进血小板的凝聚等功能达到凝血的目的。然而，这些药物由于是通过化学合成的凝血剂，存在毒性大，凝血效率低，来源有限等缺点，因此在临床应用当中有限。同时，临时性的止血也需要合适的止血方法来进行快速止血，以防人体组织受到细菌、病毒的感染。

随着对止血材料止血性能要求的不断提高，开发出止血速度更快、效果更佳的止血材料势在必行。RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列)或含有RGD序列的蛋白广泛存在于细胞外基质、血浆蛋白以及血管内皮当中，是一种重要的细胞识别位点与信号启动分子，能够与纤维蛋白、激活后的血小板细胞表面特异性相互作用，因此在止血领域具有重要的医疗价值。

噬菌体展示是将编码外源多肽的DNA序列通过基因工程技术插入到噬菌体基因的适当位置，使之稳定地表达外源多肽的技术。M13噬菌体是一种生物纳米纤维病毒(长900nm、宽7nm)，对人与动物无害，能特异性侵染含F因子的大肠杆菌，是噬菌体展示技术中的常用噬菌体。它由5种衣壳蛋白包裹一条单链环状DNA基因组(6407bp)组成，其中2700拷贝的主要衣壳蛋白pVIII位于噬菌体的侧壁，次要衣壳蛋白pIII、pVI蛋白(各5拷贝)和pIX、pVII蛋白(各5拷贝)分别组装到噬菌体的两端(图1)。噬菌体展示技术最大的特点是直接将蛋白表型和对应基因型联系了起来，展示后的多肽能在相对独立的空间保持较好的生物活性。通过噬菌体展示技术将RGD多肽展示在噬菌体表面，而RGD多肽跟血小板和纤维蛋白粘合在一起，帮助血小板形成血凝块；同时纤维状的噬菌体也能够与纤维蛋白网络相结合，促进凝血过程的发生，因此利用噬菌体展示技术展示RGD多肽可应用于止血剂的开发。

发明内容

针对传统制备技术中存在的不足，本发明提供了一种止血效果好、实用方便的噬菌体止血剂

一种噬菌体止血剂，为利用噬菌体展示技术展示RGD多肽，所述多肽的氨基酸序列通式为：Arg-Gly-Asp或Arg、Gly、Asp3种氨基酸在内的其他变形；多肽展示在噬菌体的pⅧ外壳蛋白上。

本发明还提供了噬菌体止血剂的制备方法，包括如下步骤：

1)噬菌体展示载体的构建，其具体步骤如下：

a.设计前引物和后引物用于制备RGD插入片段肽对应碱基序列：

Primer 1，引入NcoI酶切位点：5′-ATCCATGGCGCGTGGCGACGATCCCGCAAAAGCG-3′；

Primer 2，引入HindIII酶切位点：5′-GCAAGCTTTTATCAGCTTGCTTTCGAG-3′；

b.将Primer 1和Primer 1分别配成寡聚核苷酸单链溶液，以M13DNA为模板使用Phusion DNA聚合酶扩增整个编码序列；

c.将表达质粒用限制性内切酶酶切；

d.退火寡聚核苷酸链与质粒双酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接入载体，得到重组质粒；

2)TG1细胞的活化及质粒重组到TG1细胞；

a.将TG1细胞接种至LB培养基中，37℃，220r/min培养4h活化；以步骤1)中的重组质粒转化表达到宿主菌TG1细胞，37℃继续培养，得到感受态细胞；

b.挑取单菌落用于扩增细胞，质粒提取试剂盒提取质粒测序以验证质粒为阳性，证明RGD基因序列在TG1细胞表达，得到感受态TG1细胞；

3)RGD噬菌体扩增及纯化