[发明专利]一种噬菌体止血剂的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种噬菌体止血剂，为利用噬菌体展示技术展示RGD多肽，所述多肽的氨基酸序列通式为：Arg-Gly-Asp或Arg、Gly、Asp3种氨基酸在内的其他变形；多肽展示在噬菌体的pⅧ外壳蛋白上。

2.权利要求1所述噬菌体止血剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)噬菌体展示载体的构建，其具体步骤如下：

a.设计前引物和后引物用于制备RGD插入片段肽对应碱基序列：

Primer 1，引入NcoI酶切位点：5′-ATCCATGGCGCGTGGCGACGATCCCGCAAAAGCG-3′；

Primer 2，引入HindIII酶切位点：5′-GCAAGCTTTTATCAGCTTGCTTTCGAG-3′；

b.将Primer 1和Primer 1分别配成寡聚核苷酸单链溶液，以M13DNA为模板使用pVIII Phusion DNA聚合酶扩增整个编码序列；

c.将表达质粒用限制性内切酶酶切；

d.退火寡聚核苷酸链与质粒双酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接入载体，得到重组质粒；

2)TG1细胞的活化及质粒重组到TG1细胞；

a.将TG1细胞接种至LB培养基中，37℃，220r/min培养4h活化；以步骤1)中的重组质粒转化表达到宿主菌TG1细胞，37℃继续培养，得到感受态细胞；

b.挑取单菌落用于扩增细胞，质粒提取试剂盒提取质粒测序以验证质粒为阳性，证明RGD基因序列在TG1细胞表达，得到感受态TG1细胞；

3)RGD噬菌体扩增及纯化

将步骤2)中的感受态TG1细胞在37℃培养2个小时后加入辅助噬菌体，再加入IPTG作为诱导剂，过夜培养；之后高速离心收集上清去除TG1细胞；PEG/NaCl沉淀、离心收集沉淀得到RGD噬菌体颗粒，重复该步骤2次，RGD噬菌体在去离子水中溶解分散，得到RGD噬菌体水溶液，通过UV光谱计算噬菌体数量；

4)RGD噬菌体冷冻干燥；

将步骤3)中的RGD噬菌体水溶液在冷冻干燥机中-40℃冷冻干燥12-24小时，得到RGD噬菌体粉末。

3.根据权利要求2所述的一种噬菌体止血剂的制备方法，其特征在于：所述多肽展示在噬菌体的pⅧ外壳蛋白上，或pIII、pVI、pIX或pVII蛋白位点上。

4.根据权利要求2所述的一种噬菌体止血剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3)得到的RGD噬菌体水溶液浓度为：10⁵pfu/mL～10¹⁵pfu/mL。

5.根据权利要求4所述的一种噬菌体止血剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3)得到的RGD噬菌体水溶液浓度为：10¹¹pfu/mL～10¹³pfu/mL。

6.权利要求1所述RGD噬菌体或权利要求2-5任一方法制备得到RGD噬菌体在制备用于人体外伤、手术创伤的快速止血剂的用途。

7.权利要求1所述噬菌体或权利要求2-5任一方法制备得到RGD噬菌体在用于制备耳动脉止血剂的用途。

8.权利要求1所述RGD噬菌体或权利要求2-5任一方法制备得到RGD噬菌体在制备用于促进细胞及组织的粘附和生长的药物的用途。

9.权利要求1所述RGD噬菌体或权利要求2-5任一方法制备得到RGD噬菌体在制备用于疾病成像，肿瘤细胞的特异性打靶中的用途。

10.一种RGD噬菌体组合止血剂，包括权利要求1所述RGD噬菌体或权利要求2-5任一方法制备得到RGD噬菌体，和凝血促进剂、抗生素、抗真菌剂、消炎剂、止痛剂中的一种或两种以上的组合物。