[发明专利]一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体及其应用。

背景技术

氨基葡萄糖(Glucosamine,GlcN)，简称氨糖，存在多种有机体中，能够作为蛋白聚糖与糖蛋白的主要成分，在细胞内通过氨基化生成6-磷酸葡萄糖。N-乙酰化氨基葡萄糖(GlcNAc)在医药、食品以及日化等领域有着广泛的应用。传统生产工艺主要采用虾蟹来源的甲壳素为原料，较多采用酸水解进行制备，反应需要浓酸和高温条件，对环境污染严重，设备要求高，且生产成本偏高。随着代谢工程与合成生物学的迅速发展，生物发酵法运用在工业上的生产也日趋成熟，以葡萄糖为原料直接进行氨糖的转化，具有原料成本低、提取简单、产品纯度高、过程污染少等优势。

氨基葡萄糖合酶(简称氨糖合酶，gls)是GlcN生物合成的关键酶，能够催化6-磷酸果糖生成GlcN-6-P，由谷氨酰胺作为氨基供体。该步是GlcN合成途径中第一个限速反应，gls严重受该合成途径代谢产物GlcN-6-P的反馈抑制，因而GlcN-6-P在正常的代谢合成中无法大量积累。为降低这种产物抑制作用，在大肠杆菌E.coli体系中通常采用共表达氨糖乙酰化酶基因，将代谢体系中的GlcN-6-P转化为刺激性较小的GlcNAc-6-P，产物GlcN-6-P和GlcNAc-6-P均可以从胞内转移到胞外，并经去磷酸化作用形成GlcN和GlcNAc，而GlcNAc能在酸性条件下去乙酰化再次转化为GlcN。

gls的生物合成能力偏低、对产物耐受能力较差是影响产量水平提升的主要原因。尽管目前工业生产上使用的菌株已远远突破上述水平，其中大都经过系统的代谢工程技术改造和发酵优化控制，但从有关文献分析，其改造的重点之一是氨糖合酶。

发明内容

本发明旨在提供一种通过基因工程的方法克隆表达氨糖合酶以及通过易错PCR对氨基葡萄糖合酶进行定向改造，从而构建高产氨糖的工程菌的方法。该方法是一种简便、有效地获得DNA序列变异的技术，主要是针对特定的基因，这在遗传和基因改良研究中具有巨大的应用前景。该方法构建的工程菌在工业生产中周期短、能耗少、污染小，完全适合于工业化生产的要求。

本发明为探索gls新的改造策略，首先筛选出较优的表达质粒和表达宿主，进而利用易错PCR对gls进行非理性改造，通过培养基中外加氨糖作为筛选压力，筛选出耐受性提升的突变株。此外，本发明也通过共表达氨基葡萄糖乙酰化酶gnal的方式，削弱GlcN积累对宿主细胞的抑制效应，考察突变株的合成能力。

一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

上述定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

包含所述氨基葡萄糖合酶突变体基因的工程菌。

上述定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体在氨基葡萄糖生物合成中的应用，将突变体通过共表达氨基葡萄糖乙酰化酶，将发酵体系中的氨基葡萄糖转化为乙酰化氨基葡萄糖，从而减少产物的抑制效应，提升氨基葡萄糖产量。

一种通过基因工程手段定向改造氨基葡萄糖合酶的方法，包括克隆表达氨基葡萄糖合酶基因，并采用连续易错PCR，建立突变体文库进行高通量筛选，获得发酵性能提升的氨基葡萄糖合酶突变体M15-9。

所述定向改造的氨基葡萄糖合酶编码基因相对于天然酶60位的丙氨酸变为丝氨酸，128位的缬氨酸变为丙氨酸，352位的天冬氨酸变成了丙氨酸，354位的精氨酸变成半胱氨酸，422位的异亮氨酸变成蛋氨酸，432位的亮氨酸变成了缬氨酸，471位的天冬氨酸变成了谷氨酸，556位的亮氨酸变成了脯氨酸，567位的的缬氨酸变为谷氨酸。上述突变是多轮累积的结果，结构分析结果显示突变酶相对于野生酶疏水性明显增加，导致酶活性中心的残基向里或侧面聚集，同时突变酶的氢键加强，另外带负电荷的氨基酸明显减少，变成了中性氨基酸，减弱了酶分子的极性，更利于酶与底物结合的区域；以上变化改变了酶的空间构象，增加了酶与底物结合的区域，提高了酶与底物的结合效率。