[发明专利]一种富硒发酵豆粕、制备方法及应用

权利要求书

1.一种富硒发酵豆粕的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）富硒菌株选育

将产阮假丝酵母Candida utilis进行氮离子注入诱变，经过多次诱变筛选，获得耐受高浓度亚硒酸钠的酵母突变菌株，命名为C. utilis cas6；

（2）种子培养液制备

将产阮假丝酵母突变菌株C. utilis cas6接种在斜面培养基得到斜面菌株，然后将所述斜面菌株接种于种子培养基中，得到种子培养液；

（3）发酵培养

将种子培养液按体积百分含量8～12%的接种量接种至发酵培养基中，在发酵产物中补加终浓度为150～200mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养20～24h，获得发酵菌液；

（4）益生菌单株菌发酵

将地衣芽孢杆菌Bacillus Lincheniforms cas58、戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus cas138、乳酸链球菌Streptococcus lactis cas168这三株菌株分别单独进行发酵，获得各自的益生菌发酵菌液；

（5）益生菌复合菌液制备

将富硒酵母菌C. utilis cas6、地衣芽孢杆菌B. Lincheniforms cas58、戊糖片球菌P. pentosaceus cas138、乳酸链球菌S. lactis cas168四株菌株的发酵菌液按照3～5：2～3：2～3：1～2的体积比混合，制得益生菌复合菌液，其中有效活菌数为8.0×10⁹～1.3×10¹⁰ cfu/ml；

（6）新鲜培养基添加

按质量浓度2～3%向复合菌液中加入新鲜培养基质-甘蔗糖蜜；

（7）高活性富硒豆粕的制备

将豆粕、羽毛粉、麸皮、水按重量比10：2～3：1.5～2：4～5，混合后按照重量比2～3‰比例加入步骤（6）中的制得的益生菌复合菌液混合搅拌均匀，在36～42℃恒温下发酵36～48小时，烘干即可制成富硒豆粕。

2.根据权利要求1所述的一种富硒发酵豆粕的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）包括以下步骤：

（11）产朊假丝酵母Candida utilis采用YEPD培养平板上培养48～72h，挑取单菌落至含YEPD液体培养基的培养瓶中，180～200rpm，震荡培养48～72h，菌液离心洗涤，制成单细胞悬液，使细胞浓度在10⁸～10⁹个/mL；

（12）将菌悬液均匀涂布到无菌培养皿中，风干制成菌膜；

（13）在N⁺注入机中进行离子注入，能量14～18 KeV；

（14）每个菌株做6个梯度剂量，每个剂量两个平板，N⁺注入剂量分别为4.0×10¹⁴、6.0×10¹⁴、8.0×10¹⁴、1.0×10¹⁵、1.2×10¹⁵、1.4×10¹⁵ ion/cm²，并做真空对照平板；

（15）诱变完成后，加入无菌水洗涤菌体制成菌悬液；

（16）将菌悬液稀释10⁴～10⁸倍涂布于含亚硒酸钠的筛选培养基，经过多次诱变筛选，获得耐受高浓度亚硒酸钠的酵母突变菌株，而且其发酵生物量在同等条件下比出发菌株提高了2倍以上，命名为C. utilis cas6。

3.根据权利要求1所述的一种富硒发酵豆粕的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，将产阮假丝酵母突变菌株C. utilis cas6接种在斜面培养基25～30℃培养24～32h得到斜面菌株，然后将所述斜面菌株接种于种子培养基中，25～30℃，180～200r/min，振荡培养24～36h，得到种子培养液。

4.根据权利要求3所述的一种富硒发酵豆粕的制备方法，其特征在于，所述斜面培养基包括以下成分：葡萄糖15～20g/L，蛋白胨15～20g/L, 酵母膏5～10g/L, 亚硒酸钠20～30mg/L，琼脂12～18g/L。