[发明专利]一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及到一种软骨提取物的制备方法，特别涉及一种含非变性Ⅱ型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法。

背景技术

胶原蛋白是皮肤、骨骼和关节等组织的重要的组成部分，是多细胞动物的细胞外基质的主要成分。目前从哺乳动物中已经发行27种不同类型的胶原蛋白，其中由三条相同的α链组成的Ⅱ型胶原蛋白主要存在于软骨组织中和眼玻璃体中，因此Ⅱ型胶原蛋白被视为软骨的一种结构功能性元素。

目前市面在销售胶原蛋白多为经过水解后的胶原蛋白，其主要成分是多肽，分子量分布在200-20000Da的范围内。虽然这些多肽也具有一定的保持皮肤水分、增强骨密度和增强免疫力等作用，但并无预防和治疗因自身免疫机能变化引起的风湿性关节炎的功效，也不具有预防和治疗退行性关节炎的作用。

非变性Ⅱ型胶原蛋白是具有完整三螺旋结构的蛋白，当人体摄入非变性Ⅱ型胶原蛋白后，体内免疫细胞尤其是淋巴细胞的免疫耐受会发生改善，免疫耐受的原因是由于摄入的Ⅱ型胶原蛋白中含有抗原决定簇。抗原决定簇是抗原的一个特殊结构单元，能够被抗体识别和绑定，当抗体绑定到生物大分子时，抗体不能识别整个有机体或物质，但是能识别标位并进行绑定。活性抗原决定基被绑定在淋巴集结上作为一个组织存于小肠，去刺激免疫细胞、信息传递分子如细胞因子和参与增殖分化趋化因子并抑制细胞分泌去抑制炎症。

目前国内外也有一些非变性Ⅱ型胶原蛋白的提取工艺，但或是未对其原料进行除杂等预处理、或未对杂蛋白进行处理、或是提取率低、或是保存条件受限制。

发明内容

本发明目的之一是至少克服上述缺陷中的一种，提供一种新的含非变性Ⅱ型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法。

因此，本发明提供了一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的pH调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％-2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25-50℃。

本发明提供的制备方法获得的软骨提取物纯度高、提取率高、易保存、易规模化生产，且富含非变性Ⅱ型胶原蛋白和硫酸软骨素。

附图说明书

图1为实施例1获得的非变性II型胶原蛋白的透射电镜图片。

图2表示实施例1和2获得的II型胶原蛋白的western印迹的结果，其中左侧泳道是实施例2获得的II型胶原蛋白，右侧泳道是实施例1获得的II型胶原蛋白。

具体实施方式

本发明提供了一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的pH调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％-2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25-50℃。

本申请的发明人意外发现，在上述酶解条件下进行酶解，能够获得较高浓度的非变性Ⅱ型胶原蛋白。

在酶解步骤，所述酶可以采用本领域所用的任何酶，但是在一种优选的实施方式中，所述酶优选为胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶中的一种或几种；最优选为胃蛋白酶。

在一种优选的实施方式中，所酶的用量为软骨重量的0.5-2％，木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液的用量为软骨重量的1/20-1/50，酶解时间为12～20h，酶解温度25～40℃。

在另一种优选的实施方式中，加入的清液是木瓜和菠萝低温榨汁后过滤获得的混合清液，其中，木瓜和菠萝的重量比为1-10：1，优选为3-6：1。在该优选条件下，获得的软骨提取物中非变性Ⅱ型胶原蛋白浓度更高。

在一种优选的实施方式中，在干燥步骤后进行粉碎，其中，

脱脂：用一定浓度的脱脂剂浸泡软骨丁状物0.2h～6h，然后用水清洗至清洗后的水的pH到5.5～8.5；

消毒：用一定浓度消毒液浸泡脱脂后的软骨丁状物1～3次，然后用水清洗至软骨丁状物无味；

匀浆：将消毒后的软骨丁状物进行匀浆处理，匀浆后软骨的粒度为50～300目；

过滤：利用5～100目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液；

干燥：将过滤收集的过滤液进行低温干燥，干燥温度不高于30℃，干燥后获得软骨提取物；