[发明专利]一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋微生物检测技术领域，具体地，涉及一种同时检测四种海洋弧菌的试 剂盒及其检测方法。

背景技术

近年来，由于海洋渔业资源的日渐衰退，渔业捕捞量已大幅度下降，单靠海洋捕捞已 远远不能满足我国人民对海洋水产品的需求，因此，海水养殖得到普遍重视和大力发展。扩 大鱼类增养殖，开发鱼类蛋白资源是当今世界水产增养殖中最活跃的科研开发工作，水产养 殖已成为世界上增加鱼类来源最迅速的方式，也是水产品生产发展的必然趋势。

弧菌病(Vibriosis)是由弧菌属细菌(Vibrio spp.)引起的一类细菌性疾病，该病在全球范 围内广泛发生，其暴发性流行不仅给海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的养殖业造成 巨大的经济损失，还导致野生的海水鱼类、贝类及甲壳类大量死亡，因此，对该类疾病的研 究一直备受国内外研究工作者的关注，是海水养殖动物病害的主要研究领域之一。国外对海 水鱼类弧菌病的研究始于20世纪初，自20世纪60年代后相继对多种弧菌属的致病菌有较丰 富的研究和报道。在我国，海水养殖业经历了藻、虾、贝的3次养殖浪潮之后，又相继迎来 了90年代形成的海水鱼类养殖的第4次养殖高潮。然而，由于养殖面积过速扩展、养殖密度 过高和管理不当，养殖鱼类疾病繁生，造成巨大的经济损失。由弧菌引起的死亡时有报道， 弧菌病被公认为是鱼类养殖中最为严重的病害之一，是该行业发展的重要限制性因素。

做好海水中弧菌的检测是预防海洋水产疾病的重要前提，而阳性对照在海水弧菌检测 工作中必不可少，但是由于作为阳性对照的样本不易获得和不稳定性，样本直接作为阳性对 照可操作性差，不利于快速高效的对弧菌进行检测。另外，如何进一步提高普通荧光定量PCR 的灵敏度也是当前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中海洋弧菌检测缺少阳性对照物以及荧 光定量PCR灵敏度不高的缺陷和不足，提供一种含有阳性对照物的荧光定量PCR试剂盒； 所述试剂盒的灵敏度提高了100倍，基本对模板中100copies/μL的目标序列可以有效检出， 在海洋弧菌检测中具有较大的应用前景。

本发明的目的是提供一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒。

本发明的另一目的是提供利用上述试剂盒检测海洋弧菌的方法。

本发明的再一目的是提供上述试剂盒及方法的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒，包括荧光定量PCR所需试剂，还包括阳性对照物，4 对荧光PCR引物和4条分子信号探针和PCR引物；所述阳性对照物为含有霍乱弧菌、副溶 血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌16SrDNA序列的质粒；所述4对荧光PCR引物和分子信号探 针依次如SEQ ID NO.3～14所示；所述PCR引物如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明通过扩增霍乱弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌的16SrDNA靶基因， 连接到T-vector载体，一方面作为试剂盒的阳性对照物，另一方面由于重组质粒浓度稳定和 非常易于不断扩增，在试剂盒的研发过程中当作标准样本，测试检测试剂盒的特异性和敏感 性，通过将荧光定量PCR的模板预先进行普通PCR，可大大提高荧光定量PCR的灵敏度。

优选地，所述质粒为阳性质粒pMD-Vc、pMD-Vp、pMD-Vv和pMD-Va。

一种同时检测四种海洋弧菌的方法，先提取待测弧菌样品DNA，再将待测样品和权利 要求1中的阳性对照物用权利要求1中所述PCR引物SEQ ID NO.1～2进行预扩增，再将预 扩增的PCR产物用引物SEQ ID NO.3～14进行荧光定量PCR检测，通过阳性对照物比较， 计算出待测样品中四种弧菌的含量。

优选地，所述预扩增的PCR反应体系：2x Ex Taq Mixture 12.5μL，上游引物1μL， 下游引物1μL，模板3μL，ddH2O 7.5μL，共25μL；所述PCR反应程序为：95℃，4 min；94℃45s，42℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s，43℃45s，72℃45s，2个循环； 94℃45s，44℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s，45℃45s，72℃45s，2个循环；94℃ 45s，46℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s，47℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s， 48℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s，49℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s，45℃ 45s，72℃45s，15个循环；72℃，5min；4℃，Pause。