[发明专利]一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒及检测方法在审
| 申请号： | 201710277895.7 | 申请日： | 2017-04-25 |
| 公开（公告）号： | CN107312831A | 公开（公告）日： | 2017-11-03 |
| 发明（设计）人： | 张锐;兰文升;孙美榕;王康 | 申请（专利权）人： | 广东海洋大学;深圳市检验检疫科学研究院;深圳市中大创新生物科技有限责任公司 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01 |
| 代理公司： | 广州粤高专利商标代理有限公司44102 | 代理人： | 张月光,林伟斌 |
| 地址： | 524088 *** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 同时 检测 海洋 弧菌 试剂盒 方法 | ||
1.一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒，包括荧光定量PCR所需试剂，其特征在于，还包括阳性对照物，4对荧光PCR引物和4条分子信号探针和PCR引物；所述阳性对照物为含有霍乱弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌16SrDNA序列的质粒；所述4对荧光PCR引物和分子信号探针依次如SEQ ID NO.3～14所示；所述PCR引物如SEQ ID NO.1～2所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒为阳性质粒pMD-Vc、pMD-Vp、pMD-Vv和pMD-Va。
3.权利要求1或2所述试剂盒在海洋弧菌检测中的应用。
4.一种同时检测四种海洋弧菌的方法，其特征在于，先提取待测弧菌样品DNA，再将待测样品和权利要求1中的阳性对照物用权利要求1中所述PCR引物SEQ ID NO.1～2进行预扩增，再将预扩增的PCR产物用引物SEQ ID NO.3～14进行荧光定量PCR检测，通过阳性对照物比较，计算出待测样品中四种弧菌的含量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述预扩增的PCR反应体系：2x Ex Taq Mixture 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板3 μL，ddH2O 7.5 μL，共25 μL；所述PCR反应程序为：95℃，4 min；94℃ 45s，42℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，43℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，44℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，45℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，46℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，47℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，48℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，49℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，45℃ 45s，72℃ 45s，15个循环；72℃，5min；4℃，Pause。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系为：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，探针0.08 μL，Mix 10 μL，Rox 0.5 μL，预扩增产物2 μL，双蒸水补足至20 μL；所述荧光定量PCR反应程序为：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 10 min，60℃ 1 min，40个循环。
7.权利要求4～6任一所述方法在海洋弧菌检测中的应用。
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