[发明专利]一种永生化特络细胞系及其构建方法

说明书

本发明涉及一种永生化特络细胞系的构建方法，包括如下步骤：(1)将剪碎的小鼠肺脏组织块于二型胶原酶中消化，过滤，离心，收集细胞沉淀，在培养基中培养，待成纤维细胞贴壁后，将上清转移至另一培养皿，培养12小时后换液，继续培养3‑5天；(2)用微量枪头作为细胞刮，刮除成纤维细胞，反复多次刮除后，进行特异性结构telopode的观察和免疫标记鉴定特络细胞；(3)以特络细胞作为宿主细胞，用含有SV‑40‑大T抗原的逆转录病毒载体感染宿主细胞，经过传代、筛选、鉴定。本发明的永生化特络细胞系培养至50代仍然保持较为稳定的状态，解决了现有技术多次分离和提取无法保证特络细胞纯度和稳定性的问题。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体地说，是一种永生化特络细胞系的构建方法。

背景技术

目前研究特络细胞的功能是使用不同种属动物(如小鼠、大鼠、猪等)的不同器官(肺脏、肾脏、心脏等)原代提取的特络细胞，提取过程耗时且每次提取都需要进行分离纯化和鉴定，需要投入大量的人力物力。由于多次分离和提取原代细胞是由于不同的人员进行，因此难以保证提取细胞的纯度和稳定性。在正常情况下，100％纯化的原代特络细胞低密度培养时，一周内全部死亡。

中国《中华移植杂质》2016年5月刊登的论文《大鼠肾脏皮质中分离出新型间质细胞-特络细胞》，分离纯化及原代培养TC：在无菌条件下获取大鼠肾脏皮质，使用无菌剪刀将组织剪成约1mm×1mm的块状，PBS清洗3次，消化液为使用不含钙离子及镁离子的PBS配置的10mg/mL二型胶原酶及2000U/mL DNA酶，将组织置于37℃振荡器中消化4h，收集的细胞玄烨1500转离心5min，移至40μm细胞过滤器中过滤，细胞接种于10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱培养，使用显微切割的方法去除杂细胞，具体方法如下：TC成簇生长后，于相差显微镜下利用细胞刮刀刮除杂细胞，弃去上层杂细胞悬浮液PBS冲洗，重复直至效果满意，而后行细胞传代。中国专利2016101653339公开了一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法，以犬脂肪间充质干细胞作为宿主细胞，转染携带SV40大T抗原的慢病毒载体，将Tag基因整合入犬脂肪间充质干细胞基因组中，经过连续传代筛选得到表达SV40大T抗原基因且具有多向分化潜能的细胞系。然而现有技术中，关于本发明永生化特络细胞系的构建方法，目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种永生化特络细胞系的构建方法。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供由如上所述方法构建获得的永生化特络细胞系。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种永生化特络细胞系的构建方法，包括如下步骤：

(1)将剪碎的小鼠肺脏组织块于二型胶原酶中消化，过滤，离心，收集细胞沉淀，在含有10％FBS的DMEM/F12培养基中培养，待成纤维细胞贴壁后，将上清转移至另一培养皿，培养12小时后换液，继续培养3-5天；

(2)用微量枪头作为细胞刮，刮除成纤维细胞，反复多次刮除后，进行特异性结构telopode的观察和免疫标记鉴定特络细胞；

(3)以特络细胞作为宿主细胞，用含有SV-40-大T抗原的逆转录病毒载体感染宿主细胞，经过传代、筛选、鉴定。

进一步，所述含有SV-40-大T抗原的逆转录病毒载体为EF1A-SV40-IRES-puro逆转录病毒载体。

进一步，所述步骤3包括：

(1)设计合成引物，以含有SV40大T抗原基因的质粒为模板进行PCR扩增，通过两端所含酶切位点将其连入酶切后的过表达慢病毒载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的目的基因过表达慢病毒载体；