[发明专利]一种永生化特络细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种永生化特络细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将剪碎的小鼠肺脏组织块于二型胶原酶中消化，过滤，离心，收集细胞沉淀，在含有10％FBS的DMEM/F12培养基中培养，待成纤维细胞贴壁后，将上清转移至另一培养皿，培养12小时后换液，继续培养3-5天；

(2)用微量枪头作为细胞刮，刮除成纤维细胞，反复多次刮除后，进行特异性结构telopode的观察和免疫标记鉴定特络细胞；

(3)以特络细胞作为宿主细胞，用含有SV-40-大T抗原的逆转录病毒载体感染宿主细胞，经过传代、筛选、鉴定；

所述步骤(3)包括如下步骤：

(a)设计合成引物，以含有SV-40-大T抗原基因的质粒为模板进行PCR扩增，通过两端所含酶切位点将其连入酶切后的过表达慢病毒载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆，即为构建成功的目的基因过表达慢病毒载体；

所述的引物序列如下：

(b)用构建的慢病毒表达载体和包装质粒共转染慢病毒包装细胞，包被病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度；

(c)用含8μg/mL Polybrene的新鲜培养基稀释病毒原液，加入到靶细胞中，6小时后换液，向细胞中加入2μg/mL puromycin，37℃，5％CO₂，常规培养24h，筛选性能稳定的永生化特络细胞系；

所述含有SV-40-大T抗原的逆转录病毒载体为EF1A-SV40-IRES-puro逆转录病毒载体。

2.由权利要求1所述方法构建的永生化特络细胞系。