[发明专利]一种高间苯三酚合成能力的基因工程菌及构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种高间苯三酚合成能力的基因工程菌及构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的构建方法1)制备含有分子伴侣蛋白groESL基因的重组质粒；2)制备含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因ACCase的重组质粒；3)将步骤1)和步骤2)所得重组质粒导入到感受态细胞中，获得重组菌株。利用本发明提供的方法制备的基因工程菌，合成间苯三酚的能力得到明显提高。

技术领域

本发明涉基因工程及发酵工程领域。

背景技术

间苯三酚又名1,3,5-三羟基苯、均苯三酚，是一种重要的精细化工产品，是合成黄酮、异黄酮类药物的中间体，间苯三酚本身可作为一种优良的平滑肌解痉药物，广泛应用于临床。间苯三酚还能抑制过氧化物酶活性，具有抗炎抗氧化作用，它可催化H₂O₂分解为分子氧和水，是一种重要的抗氧化酶。此外，间苯三酚还是一种性能优越的抗养护剂、稳定剂、燃料偶合剂、轮胎增粘剂等，具有广阔的市场需求。目前，间苯三酚的工业化生产方法主要为化学合成法，包括三硝基甲苯(TNT)法、异丙基苯法、氯代苯法和苯胺法。化学合成法存在多种弊端，如原料来源困难、副产物较多、分离提纯困难、环境污染严重等。以微生物发酵生产间苯三酚，可以克服化学法的多种弊端，并且生物法合成间苯三酚周期短，安全环保。

异源表达荧光假单胞菌聚酮合成酶基因phlD可以合成间苯三酚(Jihane Achkar,Mo Xian,Huimin Zhao,J.W.Frost.Biosynthesis of phloroglucinol[J].Journal ofthe American Chemical Society,2005,127(15):5332-5333.；Wenjuan Zha,SherylB.Rubin-Pitel,Huimin Zhao.Characterization of the substrate specificity ofPhlD,a type III polyketide synthase from Pseudomonas fluorescens[J].Journalof Biological Chemistry,2006,281(42):32036-32047.)。在此基础上表达多重抗性激活因子marA，增强大肠杆菌对间苯三酚的耐受性，表达大肠杆菌自身的乙酰CoA羧化酶基因(ACCase)，细胞内丙二酸单酰CoA的水平为原始菌株的3.6倍(Yujin Cao,Xinglin Jiang,Rubing Zhang,Mo Xian.Improved phloroglucinol production by metabolicallyengineered Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2011,91:1545–1552.)。然而，上述间苯三酚合成工程菌的产量还比较低，离实际应用的要求尚有一定差距，难以满足工业生产的需求。原因之一在于:间苯三酚作为一种酚类物质，本身就是一种优良的杀菌剂，对大肠杆菌的正常生长具有严重的抑制作用,由于间苯三酚抑制了大肠杆菌的生长,导致其合成产量无法提升。因此,我们需要进一步对工程菌株进行基因改造，以期提高间苯三酚的合成能力。groESL是大肠杆菌内重要的热激分子伴侣蛋白，该调节因子对间苯三酚发酵生产的影响暂无报道。

发明内容

为了解决目标产物间苯三酚本身作为一种酚类物质具有杀菌作用,抑制大肠杆菌正常生长从而降低其自身产量的问题，本发明的一个目的在于提供一种高间苯三酚合成能力的基因工程菌及其构建方法，该方法是为了增强大肠杆菌对间苯三酚的耐受性，降低间苯三酚对大肠杆菌正常生长的抑制作用，进而提高大肠杆菌合成间苯三酚产量。具体步骤为：

1)制备含有分子伴侣蛋白groESL基因的重组质粒；

2)制备含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因ACCase的重组质粒；

3)将步骤1)和步骤2)所得重组质粒导入到感受态细胞中，获得重组菌株。