[发明专利]一种高间苯三酚合成能力的基因工程菌及构建方法和应用

权利要求书

1.一种高间苯三酚合成能力的基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)制备含有分子伴侣蛋白groESL基因的重组质粒；

2)制备含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因ACCase的重组质粒；

3)将步骤1)和步骤2)所得重组质粒导入到感受态细胞中，获得重组菌株；

步骤1)所述分子伴侣蛋白groESL基因来源于细菌，为groES蛋白和groEL蛋白的基因；上述步骤具体为：

1)将分子伴侣蛋白groESL基因连接到载体pET28a(+)上，获得重组质粒pET-groESL；

所述分子伴侣蛋白GroESL的基因为groES和groEL，来源于大肠杆菌，groES GenebankID：948655，groEL Genebank ID：948665；

2)将聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase连接到载体pACYC上，获得重组质粒pACYC-phlD/marA/accADBC；

所述聚酮合成酶基因phlD，来源于荧光假单胞菌，Genebank ID：11830552；所述多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌，Genebank ID：6060688；所述乙酰CoA羧化酶基因ACCase，来源于大肠杆菌，其中，亚基accA的Genebank ID：6062185，亚基accB的GenebankID：6058890，亚基accC的Genebank ID：6058863，亚基accD的Genebank ID：6059083；

3)再将步骤1)和步骤2)所得的重组质粒pET-groESL和pACYC-phlD/marA/accADBC导入到感受态细胞E.coliBL21(DE3)中获得重组菌株。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤3)所述感受态菌株，是大肠杆菌E.coliBL21(DE3)的感受态菌株。

3.根据权利要求1-2任一所述方法制备的基因工程菌，其特征在于：包含含有分子伴侣蛋白groESL基因的重组质粒和含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因ACCase的重组质粒。

4.利用权利要求3所述基因工程菌生产间苯三酚的方法，其特征在于：将所述基因工程菌通过摇瓶培养或发酵罐培养生产间苯三酚。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于：具体步骤如下：

1)基因工程菌种子液按照接种量为培养基体积的1％-5％接种于培养基，培养温度为30-37℃，搅拌速度为300-800rpm，pH6.0-8.0，溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀为8-12，然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.1-1mmol/L，以40-80％的葡萄糖为底物继续分批补料发酵12-24h后结束培养；

2)将步骤1)得到的培养液进行离心取上清，上清采用等体积的乙酸乙酯萃取1-3次；

3)合并2)中所述萃取产物，减压蒸馏浓缩，所得固体粉末即为间苯三酚。