[发明专利]一种硬质秸秆发酵菌剂的配制方法

权利要求书

1.一种硬质秸秆发酵菌剂的配制方法，包括以下步骤：

第一步，选定菌种：以真菌白腐菌和细菌枯草芽孢杆菌为配制用于硬质秸秆发酵菌剂的原料菌种；所述真菌白腐菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，真菌白腐菌对纤维素降解能力较强；所述细菌枯草芽孢杆菌自行培养；

对于上述选用的原料菌种，都需要通过常规的手段，测定其对烟草主要病原菌拮抗作用，鉴定选用的活性菌株分子；确定其用于配制混合菌剂的可行性;

第二步，菌种的培养：

（1）真菌白腐菌的培养

① 真菌白腐菌母种的培养

事先将玉米粒浸泡72 h 后装袋，并于121℃下高压蒸汽灭菌30-40 min后冷却备用；接着将活化后的白腐菌接种于玉米粒培养基，置恒温培养箱内28℃培养，等到菌丝长满整个玉米粒之后备用；

② 真菌白腐菌的扩大培养

将培养好的白腐菌母种接入到麦麸棉籽壳混合培养基中，置恒温培养箱内28℃培养，待培养基表面长满菌丝后，每48 h翻抛1次，直到白腐菌布满整个麦麸棉籽壳培养基;

（2）细菌枯草芽孢杆菌培养

① 枯草芽孢杆菌种子液的制备：将保存的枯草芽孢杆菌菌株在NA固体培养基、平板上于37℃培养箱中培养16 h，然后挑取单菌落于种子培养基中，37℃，170r·min^-1条件下培养16 h作为种子液;

② 枯草芽孢杆菌的固体发酵：将麦麸与按照质量配比3∶1组成的棉籽壳混合物在121℃、30 min间隔灭菌两次，得到麦麸棉籽壳混合培养基；然后将枯草芽孢杆菌种子液按10%的接种量接入到麦麸棉籽壳混合培养基中，麦麸棉籽壳混合培养基的添加量为20%，含水量为60%，发酵温度为28℃，翻抛次数为1次/24 h；实现枯草芽孢杆菌的固体发酵;

第三步 白腐菌、枯草芽孢杆菌混合菌剂的配制

取第二步扩大培养后的白腐菌和扩大培养后的枯草芽孢杆菌按照1∶3的质量配比混合均匀，然后按照每包1000g的量装入事先消毒杀菌的容器，储存在阴凉、干燥、通风、避光处、避免和有毒物品一起储运;

在上述储运条件下保质期18个月。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于第一步中所述测定对烟草主要病原菌拮抗作用，是对烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌进行拮抗试验；所述鉴定选用的活性菌株分子包括PCR扩增、DNA序列测定与分析。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于第二步中所述混合培养基是麦麸棉籽壳与棉籽壳按照质量配比3∶1的混合物，在121℃、30 min间隔灭菌两次制得的；所述NA固体培养基是用牛肉膏3.0g、NaCl5.0g、蛋白胨10.0g、琼脂15-20 g、水1000mL配制而得的，其pH7.2-7.5；所述种子培养基是用牛肉膏3.0 g、NaCl5.0g、蛋白胨10.0g、水1000 mL配制而得的，其pH7.2-7.5。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于第三步中所述容器可以是包装袋、包装桶、包装罐、玻璃瓶中的一种。