[发明专利]基于高通量测序用于地中海贫血大样本筛查的建库方法

说明书

一种基于高通量测序用于地中海贫血大样本筛查的建库方法，包括：使用带有标签序列的特异性引物分别扩增HBA1、HBA2和HBB基因，其中标签序列用于区分不同样本；将不同样本的相同基因的扩增产物混合，然后将混合后的不同基因的扩增产物混合；对混合产物进行纯化；对纯化产物进行不完全打断；进行5’磷酸化平末端修复和3’末端加A，获得具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段；将DNA片段与含有区分文库的唯一条形码序列的接头相连；对连接产物进行纯化，获得适用于高通量测序的上机文库。本发明的方法能够覆盖目前已知的与地中海贫血相关的245种HBB基因突变类型和93种HBA基因突变类型，同时也能检测出目标区域范围内的新发型别。

技术领域

本发明涉及地中海贫血检测技术领域，具体涉及一种基于高通量测序用于地中海贫血大样本筛查的建库方法。

背景技术

地中海贫血是一种珠蛋白生成障碍性贫血，由于基因缺陷造成血红蛋白中一种或者多种珠蛋白链合成缺失或者不足。γ、δ、和β珠蛋白组成β基因族，ζ和α珠蛋白组成α基因族；地中海贫血也分为α型、β型、δβ型和δ型四种，其中以β和α地中海贫血较为常见。α-地中海贫血相关基因包括HBA2和HBA1，β-地中海贫血相关基因为HBB；位于HBA1上的类型多达348个，位于HBA2上的突变类型则为431个，HBB上的突变类型为887个；其中与地中海贫血相关的突变类型有484个，其中包括大片段缺失、点突变、缺失重复等。

地中海贫血的发生主要分布在地中海沿岸地区，其次为中东、印度、东南亚及我国南方地区；其中我国长江以南各省是地中海贫血高发期，广东、广西、福建、海南等尤为突出。中国人群中常见的α-地中海贫血有-α^SEA、-α^3.7、-α^4.2、α^CS、α^QS和α^WS六种缺失型，常见的β-地中海贫血主要有26种点突变型，此外还存在其他数百种在中国人群发生频率较低的突变类型。

目前地中海贫血尚无根治的方法，只能依靠传统方法治疗，即以输血治疗为主，给患者造成极大的经济负担，因此对地中海贫血携带者进行筛查从而指导生育是具有重要意义的。

目前对于缺失型突变的检测主要采用Gap-PCR法，而检测突变型地中海贫血则主要采用sanger测序、MLPA、芯片杂交法或者荧光定量PCR法等其他方法。其中，sanger测序法的优势是能检出目标区域内的已知和未知突变，其缺点是通量低，不适用于大规模筛查。而芯片杂交发和荧光定量PCR法通量相对更高一些，但只能检出已知突变，且检出位点相对较少，在大规模地中海贫血筛查过程中，可能造成一些罕见突变型的漏检。

发明内容

本发明在整理和分析珠蛋白基因HBA1、HBA2、HBB上的与地中海贫血疾病相关的突变位点的基础上，在基因序列两端保守区域设计标记有特定标签序列的特异性引物，将PCR产物进行大样本混合建库。使用本发明的文库并使用高通量测序对PCR片段进行全长测序，不仅覆盖目前已知的与地中海贫血相关的245种HBB基因突变类型和93种HBA基因突变类型，同时也能检测出目标区域范围内的新发型别。

本发明提供一种基于高通量测序用于地中海贫血大样本筛查的建库方法，通过使用在5’端修饰有特定标签序列的特异性引物，对HBA1、HBA2、HBB基因进行扩增，利用超声波打断仪对PCR产物进行不完全打断，再将测序通用接头序列连接到打断产物两端，构建高通量测序文库。本发明的文库经质控上机测序，下机数据可以利用特异性引物两端的标签序列区分样本信息。本发明的方法通量大、操作简单、准确度高、不仅可以检测已知型别，同时也能检出新发的未知型别。

本发明包括如下技术方案：

一种基于高通量测序用于地中海贫血大样本筛查的建库方法，包括：

(1)使用带有标签序列的特异性引物分别扩增HBA1、HBA2和HBB基因，其中上述标签序列用于区分不同样本；