[发明专利]基于高通量测序用于地中海贫血大样本筛查的建库方法

权利要求书

1.一种基于高通量测序用于地中海贫血大样本筛查的建库方法，其特征在于，包括：

(1)使用带有标签序列的特异性引物分别扩增HBA1、HBA2和HBB基因，其中所述标签序列用于区分不同样本；

(2)将不同样本的相同基因的扩增产物混合，然后将混合后的不同基因的扩增产物混合；

(3)对上一步的混合产物进行纯化；

(4)对上一步的纯化产物进行不完全打断，然后对打断产物进行纯化；

(5)对上一步的纯化产物进行5’磷酸化平末端修复和3’末端加A，获得具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段；

(6)将上一步的DNA片段与含有区分文库的唯一条形码序列的接头相连，获得可以区分文库信息的连接产物；和

(7)对所述连接产物进行纯化，获得适用于高通量测序的上机文库。

2.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，用于扩增HBA1基因的特异性引物序列如下所示：

HBA1-F：BBBBBBAGCATAAACCCTGGCGCGC(SEQ ID NO：1)；

HBA1-R：BBBBBBCTCAGCAAACGTGCCAGGCA(SEQ ID NO：2)；

用于扩增HBA2基因的特异性引物序列如下所示：

HBA2-F：BBBBBBCAAGCATAAACCCTGGCGCGC(SEQ ID NO：3)；

HBA2-R：BBBBBBTATCCCGGAATGTGCCAACAATGG(SEQ ID NO：4)；

用于扩增HBB基因的特异性引物序列如下所示：

HBB1-F：BBBBBBGCCAGTGCCAGAAGAGCC(SEQ ID NO：5)；

HBB1-R：BBBBBBGAATGGGAAACAGACGAATGAT(SEQ ID NO：6)；

HBB2-F：BBBBBBTTTCAGGGCAATAATGATACAATG(SEQ ID NO：7)；

HBB2-R：BBBBBBGGAATGTGGGAGGTCAGTGC(SEQ ID NO：8)；

其中，BBBBBB表示所述标签序列，所述标签序列互相不同。

3.根据权利要求2所述的建库方法，其特征在于，所述步骤(2)中，不同样本的相同基因的扩增产物按照等体积混合；混合后的不同基因的扩增产物，按照HBA1、HBA2、HBB1、HBB2扩增产物体积比为1：1：2：2混合。

4.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述纯化采用磁珠纯化。

5.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述接头序列如下：

正链：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ IDNO：9)；

负链：

5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACBBBBBBBBATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’(SEQ ID NO：10)；其中BBBBBBBB为所述条形码序列。

6.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述步骤(4)中打断采用超声波打断仪进行。