[发明专利]利用受限空间中超分子水凝胶冻存雪旺细胞的方法

说明书

本发明公开了一种利用受限空间中超分子水凝胶冻存雪旺细胞的方法。将已贴壁的雪旺细胞经消化，离心，加入溶有凝胶因子的细胞全培养基并吹散，得到含有凝胶因子的雪旺细胞悬浮液；将所得细胞悬浮液和冻存保护剂导入微通道中；将微通道置于3～5℃冰水浴中，平衡4～5min；最后将微通道直接置于程序降温盒，并放入‑82～‑78℃冰箱。由于超分子水凝胶在受限空间中形成的交联网络结构较非受限空间更加紧密，因此在微通道中的超分子水凝胶比微通道外的超分子水凝胶对细胞的冷冻保护更好。与传统软刻蚀法得到的微通道装置相比，利用玻璃毛细管得到的微流控装置成本更低，制作更为简单，且可冻存体积更大。

技术领域

本发明属于细胞低温冻存技术领域，具体涉及一种雪旺细胞的低温冻存方法。

背景技术

近年来，随着活体细胞和组织在医学，生物学，药学等多个领域的广泛应用，对活体细胞和组织的需求也日益增长，而离体的细胞和组织在常温下难以实现长期保存和长途运输，且细胞的体外培养本身过于耗时耗材。因此，低温冻存作为目前最常用的对活体细胞和组织的保存技术，逐渐成为近年来的研究热点。在传统的低温冻存过程中，随着温度的下降，细胞的生理活动被迫停止，而当温度恢复至生理温度，细胞复苏，细胞又可恢复活性，发挥其生理功能。然而现有的冻存方法会对细胞造成一定程度的冰晶损伤，以及由于冻存保护剂的加入和难以去除带来的毒性伤害，体积变化损伤和渗透损伤。

目前将凝胶应用于低温冻存的研究报道中，多为利用水凝胶包埋活细胞的方法来减少低温损伤。Hang等研究了利用海藻酸-多聚赖氨酸-海藻酸微胶囊做微囊化肝细胞冻存相对于直接对肝细胞冻存的影响，复苏后的检测结果表明，微囊化冻存组相对直接冻存组，生存能力更强，附件效率也更高。Haishui Huang等发现海藻酸盐水凝胶微囊化的细胞可以在冻存后的复苏过程中有效的抑制反玻璃化，从而保护细胞免受其内部的冰晶对细胞造成的伤害。但微胶囊的包裹会限制甚至阻碍贴附型细胞的贴壁、迁移、增殖和分化。例如：KuldipSidhu等研究了海藻酸盐水凝胶微囊化的人体胚胎干细胞(hESCs)和未被包埋的胚胎干细胞的活性和干性。研究结果表明，被海藻酸盐凝胶包埋的的活性和干性都较未包埋的hESCs低，且海藻酸盐凝胶囊膜难以去除。

与传统凝胶通过化学交联的方法形成凝胶态不同，超分子水凝胶由低分子的有机化合物即凝胶因子在水中通过分子间非共价键作用(如氢键，静电作用，π-π共轭)形成交联得到三维网络状结构，进而形成凝胶态。因而超分子水凝胶的交联方式属于物理交联，更加接近自然界中生物体的交联结构。因此，超分子水凝胶的生物相容性极佳。此外，分子间非共价键的作用本身可逆，因而超分子凝胶通常也是可逆的，并且还可能具备自修复特性和刺激响应性。因此，作为一种软物质材料，超分子水凝胶在药物载体，生物医学等领域的应用广泛。

目前相关的报道多利用水凝胶微胶囊来冻存细胞或组织，而基于超分子凝胶在微流控装置中的低温保存研究却很少。微流控技术作为一种可以在截面尺寸为微米级的微型通道内操控流体的中心技术，在许多微型系统包括化学，生物和医药等方面应用广泛。常见的微通道包括由软刻蚀技术制得的PDMS硅胶通道和由毛细管构成的玻璃微通道。相比PDMS硅胶微通道形成的微流控装置，玻璃毛细管微流控装置的制作成本更为低廉，方法更为简便，且存储量更大。

雪旺细胞最早是在1939年被Theodor Schwann发现和命名的一种胶质细胞。雪旺细胞通过在外周神经系统中增殖，迁移和分化等形成鞘突，鞘和轴突一起构成了一个神经纤维。研究表明，雪旺细胞对周围神经的发育和再生等影响重大。Wang等通过移植技术将雪旺细胞移植到坐骨神经损伤处，成功使坐骨神经再生。因此，雪旺细胞对神经修复有重要意义。对雪旺细胞进行冷冻保存可以帮助更好地研究其生物学特征和临床应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种雪旺细胞的低温冻存方法，减少被包埋的雪旺细胞在冻存过程中受到的损伤，提高复温后雪旺细胞的存活率，并保证其正常的增殖情况。

为达到上述目的，采用技术方案如下：