[发明专利]真菌DNA提取液及提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种真菌DNA提取液及提取方法。

背景技术

真菌感染是临床常见的疾病之一。对人类有致病性的真菌约有300多种。根据侵犯人体部位的不同，临床上将致病真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌仅侵犯皮肤、毛发和指甲，而深部真菌能侵犯黏膜、深部组织和内脏，甚至引起全身播散性感染。

目前，临床常见真菌检测方法主要是通过形态学进行观察，但该方法培养时间长，受人员经验影响比较大，且形态比较接近的真菌难以通过该方法鉴定到种，因此通过分子测序方法进行真菌鉴定显得越来越重要。然而，真菌细胞壁成分复杂，往往难以得到充分裂解，且真菌中富含多糖、色素、核酸酶等物质使得真菌DNA的提取更加困难，从而限制了分子鉴定方法的应用。因此，探索临床常见真菌高效、快速的DNA提取方法十分重要。

传统的真菌DNA提取方法步骤繁琐，且耗时较长，不符合真菌分子快速鉴定方法的需求。而市售的DNA提取液，在某些真菌DNA提取方面效果不佳，提取效率不高，使用范围相对不够广。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够快速、有效的提取真菌DNA的真菌DNA提取液及提取方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下。

一种真菌DNA提取液，包括质量百分含量为4％-6％的Chelex-100、8mM-12mM的pH为8.0-8.7的tris-HCl、0.08mM-0.12mM的EDTA-Na₂、质量百分含量为0.08％-0.12％的NaN₃、200μg/ml-250μg/ml的蛋白酶K以及13mg/ml-15mg/ml的蜗牛酶。

在其中一个实施例中，所述Chelex-100的质量百分含量为5％；所述tris-HCl的浓度为10mM，pH为8.3，所述EDTA-Na₂的浓度为0.1mM；所述NaN₃的浓度为0.1％；所述蛋白酶K的浓度为200μg/ml；所述蜗牛酶的浓度为13mg/ml。

一种真菌DNA提取方法，使用上述任一实施例所述的真菌DNA提取液进行提取。

在其中一个实施例中，在提取过程中，按照每50μl的真菌DNA提取液加入45mg-55mg的真菌菌体的比例将待提取DNA的真菌菌体加入至所述真菌DNA提取液中，得到混合液。

在其中一个实施例中，在提取过程中，将真菌菌体与真菌DNA提取液的混合液置于55℃-58℃下保温以裂解细胞壁，释放出DNA，之后再置于95℃-100℃下保温使蛋白质变性，同时chelex-100吸附各种杂质以对DNA进行纯化，最后离心收集上清液

在其中一个实施例中，在55℃-58℃下保温时间为1h-2h；在95℃-100℃下保温时间为10min-15min。

在其中一个实施例中，在提取过程中，按照每50μl的真菌DNA提取液加入50mg的真菌菌体的比例将待提取DNA的真菌菌体加入至所述真菌DNA提取液中；

在提取过程中，将真菌菌体与真菌DNA提取液的混合液先置于56℃下保温1小时，再置于100℃下保温10分钟，最后离心收集上清液。

在其中一个实施例中，所述离心的转速为13000rpm，时间为10分钟。

在其中一个实施例中，在将待提取DNA的真菌菌体加入至真菌DNA提取液之前，还包括破碎所述真菌菌体的细胞壁的步骤。

在其中一个实施例中，所述破碎所述真菌菌体的细胞壁是使用液氮研磨的方法。

上述真菌DNA提取液中通过添加蜗牛酶，可以有效裂解细胞壁，使细胞内涵物有效释放；通过添加NaN₃可以促进蛋白质变性，防止提取到蛋白质成分对检测结果造成影响；通过添加蛋白酶K，可进一步溶解变性的蛋白质；通过添加Chelex-100可以选择性地结合多价阳离子，去除样品和缓冲液中的金属离子，避免煮沸过程中模板DNA的降解。通过使用该真菌DNA提取液，各组分可以发挥协同作用进行真菌菌体DNA的提取，该提取液中的两种酶和chelex-100这三个成分都是不可缺少的，蛋白酶K和蜗牛酶对于细胞壁的裂解是十分重要的，二者联合应用可以提高破壁效率，缩短孵育时间；chelex-100在除杂方面优势比较明显，尤其在暗色真菌DNA提取方面优势更大，通过该方法获得的DNA纯度更高。