[发明专利]鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT‑LAMP检测引物组、试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于牛病毒检测技术领域，尤其涉及一种鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)和水泡性口炎(Vesicular stomatitis virus，VSV)是两种牛常见高度急性病毒传染病，一般呈暴发性流行，一旦暴发必给养牛业造成巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。FMDV和VSV引起的临床病状非常相似，均表现为流涎，发烧，跛行，口腔、乳头和蹄部冠状带等处发生水泡及溃疡。两种病常存在混合感染，难以区分。因此急需建立口蹄疫和水泡性口炎的快速鉴别检测技术，为我国FMDV和的VSV防控提供技术支持。

目前，FMDV分为7个血清型：A、O、C、SAT 1、SAT 2、SAT 3、Asia 1型，每个型又可以进一步分为不同的亚型。我国流行的为A、O和Asia 1型。VSV分为新泽西型(NJ型)型和印第安型(IND型)，在引起家畜发病的血清型中，NJ型占多数。

目前，OIE推荐的检测FMDV和VSV的分子生物学方法主要是RT-PCR和荧光RT-PCR方法。但RT-PCR和荧光RT-PCR都有一些自身的局限性，如RT-PCR敏感性较低，荧光RT-PCR成本较高，需要昂贵的仪器设备等。环介导的体外等温扩增检测技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)在PCR方法上发展起来的新兴核酸检测技术，突破了恒温扩增的技术难点，6条引物同效率时增，敏感性高，特异性好，已在多种疾病的检测上得到应用。目前，国内的多重LAMP方法都有一定的局限性，不能确定具体到底是哪一种阳性反应所引起的结果，不是真正意义上的鉴别诊断。

发明内容

本发明提供了一种鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用，本发明首次在LAMP方法中引入了荧光基团，建立了FMDV和VSV二重荧光RT-LAMP方法，通过颜色观察可同时鉴别诊断FMDV和VSV。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT-LAMP检测引物组，包括2组特异性引物，其中1组为FMDV-F3、FMDV-B3、FMDV-FIP(F1c-F2)和FMDV-BIP(B1c-B2)，另1组为VSV-F3、VSV-B3、VSV-FIP(F1c-F2)和VSV-BIP(B1c-B2)，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.8所示的序列。

作为优选，所述的引物FMDV-FIP(F1c-F2)的5’端标记FITC荧光基团，该基团在520nm波长下呈黄绿色；所述的引物VSV-FIP(F1c-F2)的5’端标记CY5.5荧光基团，该基团在670nm波长下呈大红色。

一种鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒，其反应体系为25μL：1μL RNA模板，10×buffer 2.5μL(成分为200Mm Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，80mM MgSO₄，100mM(NH₄)₂SO₄，1％Tween 20，8M betaine，and 14m dNTPs，15U of Bst DNA聚合酶，20U AMV逆转录酶，内引物各40pmol，外引物各5pmol。

作为优选，所述的内引物为FMDV-FIP，FMDV-BIP，VSV-FIP和VSV-BIP，其分别具有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的序列；所述的外引物为FMDV-F3，FMDV-B3，VSV-B3和VSV-F3，其分别具有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的序列。

本发明还提供了所述的用于鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT-LAMP检测引物组、所述的鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒在鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒中的应用。

本发明具有如下有益效果：