[发明专利]双sgRNA表达质粒及其文库的构建方法

说明书

本发明公开了一种双sgRNA表达质粒及其文库的构建方法。本发明所提供的方法一是利用两轮golden gate拼装技术，将预先设计在寡核苷酸上的编码双sgRNA中的间隔RNA的DNA片段插入到载体中；方法二是利用三轮golden gate拼装技术构建随机双敲除sgRNA表达质粒文库。本发明所提供的构建双sgRNA表达质粒文库的方法与现有方法相比，操作更加简便且大大缩短了构建时间。本发明对于鉴定非编码区基因的生物学功能以及鉴定基因与基因的相互作用具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种双sgRNA表达质粒及其文库的构建方法。

背景技术

基因功能的筛选可以深入研究细胞内生理过程，了解疾病发生和发展过程，具有重要的作用。这通常需要对细胞内的基因进行沉默或者删除。最初研究者采用将转座子插入到基因组或者通过化学突变的方式进行基因突变[Carette J E,Guimaraes C P,Varadarajan M,et al.Haploid genetic screens in human cells identify hostfactors used by pathogens[J].Science,2009,326(5957):1231-1235.]。这种方式导致的突变基因的查找过程复杂，并没有得到广泛的应用。之后，RNA干扰(RNAi)技术的出现，在一定程度上解决了上述方法的问题。RNA干扰技术根据目标基因设计一系列短链RNA，使其在后转录过程中与目标基因mRNA互补结合，从而降解mRNA或阻止其翻译成蛋白质[MoffatJ,Grueneberg D A,Yang X,et al.A lentiviral RNAi library for human and mousegenes applied to an arrayed viral high-content screen[J].Cell,2006,124(6):1283-1298.]。

RNA干扰技术的出现，使研究者几乎可以干扰哺乳动物细胞内的所有基因。然而，该项技术仍存在一定的弊端。比如RNAi技术只能在一定程度上降低目标基因的表达水平，却不能完全抑制目标基因的表达。另外，RNA干扰作用依赖于短链RNA与目标mRNA的互补配对，容易因不完全匹配产生脱靶效应，干扰目标基因之外的其他基因表达水平，对最终结果造成不可预估的影响[Kaelin Jr W G.Molecular biology.Use and abuse of RNAi tostudy mammalian gene function[J].Science(New York,NY),2012,337(6093):421-422.]。功能基因的筛选仍需要一种操作简单、可以完全沉默基因表达的技术。