[发明专利]双sgRNA表达质粒及其文库的构建方法

权利要求书

1.一种构建双sgRNA表达载体的方法，包括：

（a1）利用golden gate拼装方法，采用IIs型限制性内切酶A、IIs型限制性内切酶E、IIs型限制性内切酶D和IIs型限制性内切酶F将DNA片段与出发载体1进行拼装，得到重组载体1；

所述DNA片段的序列自上游到下游依次含有：所述IIs型限制性内切酶A的识别序列、名称为sgRNA1的sgRNA的间隔RNA的编码序列、IIs型限制性内切酶B的识别序列、IIs型限制性内切酶C的识别序列、名称为sgRNA2的sgRNA的间隔RNA的编码序列、所述IIs型限制性内切酶D的识别序列；

所述出发载体1的序列自上游到下游依次含有启动子1序列、所述IIs型限制性内切酶E的识别序列、筛选标签1的编码序列、所述IIs型限制性内切酶F的识别序列、sgRNA骨架1编码序列；

所述DNA片段与所述出发载体1中，所述IIs型限制性内切酶A切割产生的粘性末端overhang与所述IIs型限制性内切酶E切割产生的粘性末端overhang互补配对；所述IIs型限制性内切酶D切割产生的粘性末端overhang与所述IIs型限制性内切酶F切割产生的粘性末端overhang互补配对；所述IIs型限制性内切酶A切割产生的粘性末端overhang和所述IIs型限制性内切酶E切割产生的粘性末端overhang均不与所述IIs型限制性内切酶D切割产生的粘性末端overhang和所述IIs型限制性内切酶F切割产生的粘性末端overhang互补配对；

（a2）利用golden gate拼装方法，采用IIs型限制性内切酶G、所述IIs型限制性内切酶B、IIs型限制性内切酶H和所述IIs型限制性内切酶C将所述重组载体1与出发载体2进行拼装，得到重组载体2，所述重组载体2即为所述双sgRNA表达载体；

所述出发载体2的序列自上游到下游依次含有：所述IIs型限制性内切酶G的识别序列、sgRNA骨架2编码序列、筛选标签2的编码序列、启动子2序列、所述IIs型限制性内切酶H的识别序列；

所述重组载体1与所述出发载体2中，所述IIs型限制性内切酶G切割产生的粘性末端overhang与所述IIs型限制性内切酶B切割产生的粘性末端overhang互补配对；所述IIs型限制性内切酶H切割产生的粘性末端overhang与所述IIs型限制性内切酶C切割产生的粘性末端overhang互补配对；所述IIs型限制性内切酶G切割产生的粘性末端overhang和所述IIs型限制性内切酶B切割产生的粘性末端overhang均不与所述IIs型限制性内切酶H切割产生的粘性末端overhang和所述IIs型限制性内切酶C切割产生的粘性末端overhang互补配对；

所述IIs型限制性内切酶A、所述IIs型限制性内切酶D、所述IIs型限制性内切酶E和所述IIs型限制性内切酶F均不同于所述IIs型限制性内切酶B和所述IIs型限制性内切酶C；

所述sgRNA骨架1和所述sgRNA骨架2均含有完整sgRNA中除间隔RNA外的功能片段；

所述IIs型限制性内切酶A、所述IIs型限制性内切酶D、所述IIs型限制性内切酶E和所述IIs型限制性内切酶F均为BsaI；

所述IIs型限制性内切酶B、所述IIs型限制性内切酶C、所述IIs型限制性内切酶G和所述IIs型限制性内切酶H均为Esp3I；

所述启动子1为U6启动子；

所述启动子2为H1启动子；

所述筛选标签1为lacZ；

所述筛选标签2为Amp抗性筛选标签；

所述sgRNA骨架2编码序列为序列2的第1278-1360位。