[发明专利]大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物及其制备方法与应用

权利要求书

1.大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2(Escherichia coli BL21/pET-32a-LCIL-17C2)，已于2016年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016782。

2.大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物，其特征在于为分子量约34kDa的大黄鱼IL-17C2重组蛋白。

3.如权利要求2所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)克隆大黄鱼IL-17C2基因全长cDNA序列，再采用PCR技术扩增出编码第25～171位氨基酸的大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段；

2)将步骤1)得到的大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a，得到含大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段的重组表达载体pET-32a-LCIL-17C2；

3)将重组表达载体pET-32a-LCIL-17C2转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株，经氨苄青霉素筛选及测序鉴定后，获得含有大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段的大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌；同时，表达载体pET-32a转化大肠杆菌BL21菌株，获得的大肠杆菌BL21/pET-32a作为对照菌株；

4)大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌在LB培养基中经0.1mM IPTG诱导、37℃振荡培养4h，将培养物离心收集菌体，Buffer A重悬后，超声破碎，分别收集菌体裂解液上清和菌体裂解液沉淀，经聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE分析证明大黄鱼IL-17C2重组蛋白以包涵体形式表达；

5)利用镍离子鳌合亲和层析介质纯化该重组蛋白：离心收集大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌培养物中菌体，用包涵体洗涤液重悬菌体，第1次超声破碎，离心收集沉淀，再用包涵体裂解液重悬沉淀，第2次超声破碎，离心收集上清后上柱，4℃结合2h，用杂蛋白洗涤液洗柱，再用6M尿素洗柱，最后用变性蛋白洗脱液洗脱，获得大黄鱼IL-17C2重组蛋白，纯化后的大黄鱼IL-17C2重组蛋白分别经缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3进行3步透析，即得到有活性的大黄鱼IL-17C2重组蛋白；所述缓冲液1的配方为：3M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.25M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween 20；所述缓冲液2的配方为：1M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.125M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween 20；所述缓冲液3的配方为：20mM Tris-HCl、150mM NaCl和5％甘油。

4.如权利要求3所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述LB培养基的配方为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/L氯化钠。

5.如权利要求3所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述Buffer A的组成为20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.5％Triton X-100和30mM咪唑，pH 7.9。

6.如权利要求3所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述包涵体洗涤液的配方为：2M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA和0.5％Triton X-100，pH 7.9；所述第1次超声破碎的时间可为10min。

7.如权利要求3所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述包涵体裂解液的配方为：8M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％β‐巯基乙醇、0.2％Triton X-100和30mM咪唑，pH 7.9；第2次超声破碎的时间可为5min。